藍(lán)莓“綠寶石”組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究

畢海林，木永青，楊正松，董順文，和志嬌，陽 翠，蘇澤春，和加衛(wèi)*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674199;2.麗江藍(lán)瑪生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司，云南 麗江 674199;3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，四川 成都 610300)

藍(lán)莓學(xué)名越桔，屬于杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)植物，為多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓果實(shí)含有豐富的花青素，具有防止腦神經(jīng)衰老、增強(qiáng)心臟功能、增強(qiáng)視力、抗癌等獨(dú)特功效，國家糧農(nóng)組織將其列為人類五大健康食品之一[1-2]。南高叢藍(lán)莓品種“綠寶石”(Emerald)由美國佛羅里達(dá)大學(xué)于1999年選育成功，樹體生長健壯，半開張，經(jīng)過4年的生長后，樹的高度可達(dá)1.5 m，樹冠直徑可達(dá)1.1 m。果實(shí)極大，藍(lán)色，果蒂痕小且干，質(zhì)地硬，果實(shí)口味甜中略有酸味，成熟期極早且較集中，產(chǎn)量高，適宜性強(qiáng)。

近幾年，“綠寶石”在我國多地試種，表現(xiàn)十分良好，在我國南方地區(qū)成熟期早，尤其是云南低緯度高海拔地區(qū)在1月份就成熟，剛好是藍(lán)莓鮮果市場的淡季，能極好地填補(bǔ)我國早熟藍(lán)莓的市場，因此是發(fā)展?jié)摿O大的早熟藍(lán)莓品種。目前，我國藍(lán)莓組織培養(yǎng)育苗技術(shù)已經(jīng)成熟。畢海林[3]、和加衛(wèi)[4]等對野生越桔進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究報(bào)道，前人等[5-10]對高叢藍(lán)莓、兔眼藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓中的部分藍(lán)莓栽培品種進(jìn)行了組織培養(yǎng)技術(shù)的研究報(bào)道，但關(guān)于早熟藍(lán)莓“綠寶石”組培快繁技術(shù)鮮見報(bào)道。筆者對藍(lán)莓“綠寶石”進(jìn)行了組織培養(yǎng)技術(shù)研究，摸索出了“綠寶石”的組培快繁技術(shù)，將有力地促進(jìn)藍(lán)莓“綠寶石”優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)?；a(chǎn)，推動了我國早熟藍(lán)莓的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)莓栽培品種“綠寶石”枝條，取自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高山經(jīng)濟(jì)植物研究所麗江新團(tuán)藍(lán)莓基地。

1.2 方法

1.2.1 外植體選取與初代培養(yǎng)

1.2.1.1 外植體選取 選擇健壯且無病蟲害的田間植株，分別在2月初取腋芽尚未萌發(fā)的2年生老枝條和4月下旬取當(dāng)年生嫩枝條；選取大棚內(nèi)有生長勢的幼苗頂端莖段。

1.2.1.2 外植體消毒 將所取枝條剪成帶1～2個(gè)腋芽或頂芽的莖段，先用洗衣粉液浸泡5 min，然后流水沖洗2 h，再放入超凈工作臺，先用70%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞溶液分別消毒10、6、4 min，無菌水浸洗5次后供接種用。

1.2.1.3 初代培養(yǎng) 將消毒后的3種外植體接種到啟動培養(yǎng)基WPM+1.0 mg/L ZT上，培養(yǎng)基pH值為5.5。每瓶培養(yǎng)基接種1個(gè)莖段，以50個(gè)莖段為1個(gè)組合，分別重復(fù)3次。45 d以后統(tǒng)計(jì)其污染率、萌發(fā)率，并測量和計(jì)算萌發(fā)新枝條的平均長度(表1)。

1.2.2 繼代增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽剪成約1 cm的莖段，接種到含不同激素的8種增殖培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基見表2，培養(yǎng)基pH值為5.5，每瓶接種10個(gè)莖段，以10個(gè)莖段為1個(gè)組合，分別重復(fù)3次，60 d后觀測苗的生長情況，并計(jì)算其增殖系數(shù)。

將繼代培養(yǎng)試管苗剪成1 cm的莖段，接種到同一種WPM培養(yǎng)基中，每瓶接種10個(gè)莖段，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為21、23、25、27、29 ℃，光強(qiáng)設(shè)定為2000 lx，培養(yǎng)基pH值為5.5，以10個(gè)莖段為1個(gè)組合，分別重復(fù)3次。60 d后觀測苗的生長情況，并計(jì)算其增殖系數(shù)(表3)。

1.2.3 試管內(nèi)生根培養(yǎng)及試管外扦插

1.2.3.1 試管內(nèi)生根培養(yǎng) 將試管苗剪成約2 cm的莖段，接種到8種生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基見表3。培養(yǎng)基pH值5.5，每瓶接種10苗，以10苗為1個(gè)組合，分別重復(fù)3次。觀測記錄各培養(yǎng)基中愈傷組織形成和生根時(shí)間，150 d后測量根長、根數(shù)、基部愈傷組織面積，并計(jì)算其生根率(表4)。

1.2.3.2 試管外扦插 將試管苗剪去基部愈傷組織，蘸1000 mg/L NAA后，分別扦插在填滿4種基質(zhì)的70孔穴盤中，4種基質(zhì)見表5。扦插以后放入大棚內(nèi)，大棚上方拉一層遮陽網(wǎng)，插好苗的穴盤上方扣上小拱棚，拱棚內(nèi)溫度控制在32 ℃以下，空氣濕度保持在80%～95%，觀測生根情況，以20苗為1個(gè)組合，分別重復(fù)3次，150 d后測量根數(shù)，并計(jì)算其生根率。

2 結(jié)果與分析

2.1 “綠寶石”不同生理年齡的外植體初代培養(yǎng)生長情況

由表1可以看出，剛?cè)氪旱?月初腋芽尚未萌發(fā)的田間種植的“綠寶石”2年生老枝條莖段，用0.1%升汞溶液消毒10 min后，污染率還較高，說明老枝條帶菌較多，較難消毒，并且沒有污染的莖段萌發(fā)率也較低，多數(shù)腋芽萌發(fā)以后也不再伸長，一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)內(nèi)部芽點(diǎn)變黑枯死，只有極少數(shù)萌發(fā)后開始緩慢地伸長。4月下旬取當(dāng)年生嫩枝莖段，雖然消毒時(shí)間較短，但是外植體的污染率低，大部分腋芽萌發(fā)，且萌發(fā)以后基本上能生長成幼嫩枝條，萌發(fā)的新枝條平均長度接近3 cm；而大棚內(nèi)有生長勢的幼苗莖段，雖然消毒時(shí)間最短，但是外植體的污染率最低，絕大部分腋芽能萌發(fā)，并且基本上能生長成幼嫩枝條，萌發(fā)的新枝條平均長度達(dá)到3 cm。最重要的是，春季、夏季、秋季，大棚內(nèi)的“綠寶石”幼苗，生長較旺盛，均可選取外植體，而且能結(jié)合幼苗的整形修剪，將剪下的幼苗頂端莖段，用作組培育苗的外植體材料，“綠寶石”幼苗經(jīng)整形修剪后，能不斷萌發(fā)出新的側(cè)枝，可進(jìn)一步將側(cè)枝剪下作為外植體材料，以此源源不斷地獲得大量組培育苗的外植體材料。因此，藍(lán)莓“綠寶石”組織培養(yǎng)，以大棚內(nèi)幼苗頂端莖段為最佳外植體。

2.2 “綠寶石”在不同條件下的繼代增殖情況

2.2.1 不同激素配比對“綠寶石”增殖的影響 由表2可以看出，培養(yǎng)60 d后，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素ZT和生長素NAA，苗基部均有較多淡綠色愈傷組織形成，絕大多數(shù)接種莖段形成單苗，叢生苗較少，增殖系數(shù)反而較低。相比較之下，較低水平的同濃度NAA伴隨著ZT濃度的升高，苗基部的淡綠色愈傷組織呈逐漸變小的趨勢，形成的叢生苗反而較多，增殖系數(shù)也相對較高。在只加細(xì)胞分裂素ZT的培養(yǎng)基中，苗基部形成愈傷組織不明顯，僅僅稍微膨大，大多數(shù)接種莖段伸長的同時(shí)，基部均分化形成較多叢生苗，僅少數(shù)為單苗，增殖系數(shù)普遍較高；但是相比較之下，伴隨著ZT濃度的增高，形成的叢生苗呈稍微減少的趨勢，但苗稍微高一點(diǎn)，增殖系數(shù)略有降低。因此，在藍(lán)莓“綠寶石”增殖培養(yǎng)過程中，較低濃度的玉米素ZT有利于“綠寶石”的增殖。

表2 “綠寶石”在不同激素配比條件下的增殖情況

2.2.2 不同溫度對“綠寶石”增殖的影響 由表3可以看出，培養(yǎng)溫度為21 ℃時(shí)，“綠寶石”的增殖系數(shù)為4.0，隨著培養(yǎng)溫度的升高，平均苗高逐漸增高，增殖系數(shù)也同時(shí)增加；29 ℃時(shí)苗最高，增殖系數(shù)達(dá)到最高，增殖系數(shù)為8.1。較高溫度(29 ℃)的增殖系數(shù)是較低溫度(21 ℃)的2倍左右。在本試驗(yàn)中，最低溫和最高溫培養(yǎng)中均沒有出現(xiàn)玻璃化苗和畸形苗，苗生長均較健壯。由此可見，在一定溫度范圍內(nèi)，高溫有利于“綠寶石”的快速增殖。

表3 不同溫度對“綠寶石”增殖的影響

2.3 “綠寶石”試管苗生根培養(yǎng)

2.3.1 不同生長素對“綠寶石”試管苗瓶內(nèi)生根培養(yǎng)的影響 由表4可以看出，“綠寶石”在8種培養(yǎng)基中，隨著苗的逐漸長高，苗基部均出現(xiàn)黃綠色愈傷組織，愈傷組織形成后，相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)基本沒變化，約3個(gè)月后開始出現(xiàn)極少量的幼根分化。150 d后測量根數(shù)，并計(jì)算其生根率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在8種培養(yǎng)基中，苗的生根率在60%～76%之間，沒生根的苗基部愈傷組織部分少量變褐。同時(shí)添加IBA和NAA的培養(yǎng)基與僅添加IBA的培養(yǎng)基相比，后者苗基部的愈傷組織要小一些，相對應(yīng)地，愈傷組織越小的培養(yǎng)基中苗的生根率稍高。由此說明，藍(lán)莓“綠寶石”試管內(nèi)誘導(dǎo)生根的時(shí)間極長，培養(yǎng)基中添加較低濃度的生長素時(shí)，苗基部形成的愈傷組織越小，生根時(shí)間稍短，生根率較高。說明在藍(lán)莓“綠寶石”試管內(nèi)生根誘導(dǎo)時(shí)，較高濃度的生長素誘導(dǎo)形成較大的愈傷組織，反而阻礙了其生根。當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L IBA時(shí)，生根率達(dá)到75.3%，是8種培養(yǎng)基中生根率最高的。因此，藍(lán)莓“綠寶石”在WPM+0.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基中生根率較高，但是生根時(shí)間他很長。

表4 不同生長素對“綠寶石”試管苗瓶內(nèi)生根培養(yǎng)的影響

2.3.2 不同基質(zhì)對“綠寶石”試管苗瓶外扦插生根的影響 由表5可以看出，“綠寶石”試管苗扦插在4種基質(zhì)中的生根情況差異較大。以鋸木屑+珍珠巖為基質(zhì)的穴盤中，苗的生根情況較差，鋸木屑中約3周后才出現(xiàn)少量短根，2個(gè)月時(shí)的生根率為67.2%；而以細(xì)沙+珍珠巖為基質(zhì)的穴盤中的苗的生根情況最差，苗的基部很容易腐爛變黑，基部不變黑的苗需要1個(gè)月左右才生根，生根率較低。草炭土+珍珠巖、苔蘚為基質(zhì)的穴盤中苗的生根情況良好，15 d左右即出現(xiàn)無色的短根，一段時(shí)間后根變白，再逐漸變黃，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)觀察發(fā)現(xiàn)，除了萎蔫的苗外，其余基本上均已長根，隨著苗逐漸長高，頂部葉片也開始展開。由此可見，苔蘚、草炭土+珍珠巖是“綠寶石”瓶外生根最好的扦插基質(zhì)。

表5 “綠寶石”試管苗在4種基質(zhì)中的生根情況

3 討論與結(jié)論

組織培養(yǎng)已成為我國生產(chǎn)藍(lán)莓優(yōu)質(zhì)種苗的一種主要方式。盡管其技術(shù)已經(jīng)較為成熟，但越桔屬不同野生種和不同藍(lán)莓栽培品種的組培技術(shù)或多或少肯定存在一定的差異。藍(lán)莓組培苗在試管內(nèi)生根效果不佳，生根慢，生根率僅為30%～70%，因此主要采用試管外生根的方法[11]。

中國南北方氣候差異大，應(yīng)因地制宜，選擇適合的時(shí)間，即氣溫回升但不太高時(shí)進(jìn)行試管苗扦插。目前，生根扦插基質(zhì)主要采用苔蘚，一般在扦插半個(gè)月左右就開始生根，生根效果好，生根率高。本試驗(yàn)采用的2種生根基質(zhì)，即苔蘚和草炭土，其生根效果都很好。但比起苔蘚來，以草炭土作為生根基質(zhì)，根部土團(tuán)容易散開，不方便運(yùn)輸，只宜就近上缽管理。而以苔蘚為基質(zhì)，生根以后，根與苔蘚很好地纏繞形成不易散開的團(tuán)塊，方便長途運(yùn)輸，且保水性好。

本試驗(yàn)表明，藍(lán)莓“綠寶石”組織培養(yǎng)以大棚內(nèi)幼苗頂端莖段為最佳外植體。在增殖培養(yǎng)過程中，較低濃度的玉米素ZT有利于“綠寶石”的增殖。在一定溫度范圍內(nèi)，高溫有利于“綠寶石”的快速增殖；“綠寶石”在試管內(nèi)需要很長的時(shí)間才能生根，在篩選出的較佳生根培養(yǎng)基1/2WPM+0.5 mg/L IBA中的生根率僅為75.3%；苔蘚和草炭土均是“綠寶石”瓶外生根最好的扦插基質(zhì)，其中以苔蘚作為扦插基質(zhì)時(shí)，苗生根后更方便運(yùn)輸。