馬錢子堿治療早期小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究*

向 杰，張海燕，李 多，朱明雙

1.南充市中醫(yī)醫(yī)院(南充 637000)；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都 610072)；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(成都 610072)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是由力學(xué)和生物學(xué)等多種原因引起，以關(guān)節(jié)軟骨退變和破壞為主要病理改變，且與年齡呈正相關(guān)的關(guān)節(jié)退行性疾病[1]。雖然KOA的病情進(jìn)展緩慢，但早期若不對(duì)KOA病變進(jìn)行干預(yù)，會(huì)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)功能紊亂，發(fā)生嚴(yán)重畸形，甚至導(dǎo)致殘疾。據(jù)流行病學(xué)[2-3]報(bào)道，KOA已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，并隨著社會(huì)老齡化發(fā)展該疾病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。在美國(guó)<65歲人群中，約有1 400萬人患有癥狀性KOA，而這其中有超過半數(shù)的患者為中晚期KOA[4]。此外，KOA引起的膝關(guān)節(jié)疼痛、畸形等癥狀還會(huì)增加心血管發(fā)生率和全因死亡率[5-6]。因此，緩解KOA疼痛等癥狀及延緩疾病進(jìn)程對(duì)KOA患者具有重要意義。

馬錢子是馬錢科植物馬錢的成熟干燥種子，古今醫(yī)家對(duì)這味傳統(tǒng)中藥在骨關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用中積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為此藥治療骨關(guān)節(jié)炎效果良好。如婁多峰教授秉承治療痹病應(yīng)“以通為用”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，認(rèn)為馬錢子既可通痹止痛，又可與補(bǔ)虛藥相伍，以扶正祛邪，標(biāo)本兼治，實(shí)為治痹之要藥[7-8]。王云川教授亦善運(yùn)用馬錢子治療骨痹病，且療效明顯[9]。馬錢子堿是從馬錢子中提取的吲哚類生物堿，其發(fā)現(xiàn)約有200年歷史[10]。研究[11]報(bào)道，馬錢子堿是馬錢子的主要有效成分，但它的毒性遠(yuǎn)低于馬錢子，其在治療骨關(guān)節(jié)炎疾病中展現(xiàn)出較大潛力。雖然已有研究[12-13]證實(shí)，馬錢子堿治療骨關(guān)節(jié)炎療效確切，但其作用機(jī)制研究報(bào)道較少。因此，本研究擬通過構(gòu)建KOA動(dòng)物模型，觀察馬錢子堿對(duì)KOA模型小鼠軟骨病變的影響，探討馬錢子堿治療KOA小鼠的作用機(jī)制，為馬錢子堿的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

10～12 周齡SPF 級(jí)的C57BL/6 雄性小鼠，體重(24±3)g，共24只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2017-204。

1.2 藥物及試劑

馬錢子堿(成都德思特生物技術(shù)有限公司)；番紅-固綠染液(北京雷根生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白酶和磷酸化酶抑制劑混合物(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)；β-actin抗體(英國(guó)Abcam公司)；MTs、ZNT9ZIP8、MTF1抗體(美國(guó)Fisher公司)。

1.3 儀器

數(shù)碼三目攝像顯微鏡BA400Digital(成都麥克奧迪有限公司)；高速冷凍離心機(jī)H1850R(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；微量核酸蛋白分析儀N50t(德國(guó)Implen公司)；熒光定量PCR儀CFX Connect、凝膠電泳儀PowerPacTM Basic(美國(guó) BIO-RAD 公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀MULTISKAN GO(美國(guó)Thermo Scientific公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0(美國(guó) Media Cybernetics公司)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)Champ Chemi 610(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

1.4 藥物制備

馬錢子堿溶液配置方法：首先用DMSO溶解馬錢子堿，將其配制成98.6 g/L的儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?避光)。實(shí)驗(yàn)前用0.9%生理鹽水稀釋至所需濃度。

1.5 分組、造模及給藥

采用內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)(destabilization of the medial meniscus，DMM)的方法建立KOA動(dòng)物模型[14-16]。C57BL/6小鼠按照完全隨機(jī)分組方法將其分為空白對(duì)照組和手術(shù)組，空白對(duì)照組6只，手術(shù)組18只，手術(shù)組采用DMM方法建立早期KOA動(dòng)物模型。然后將手術(shù)組小鼠隨機(jī)分為模型組、馬錢子堿中劑量組、馬錢子堿高劑量組，每組各6只。馬錢子堿中劑量組：每天給予5 mg/kg馬錢子堿溶液腹腔注射；馬錢子堿高劑量組：每天給予10 mg/kg馬錢子堿溶液腹腔注射；模型組：每天給予等體積的生理鹽水腹腔注射；對(duì)照組：不采取任何干預(yù)措施。給藥過程中密切觀察小鼠情況，藥物干預(yù)4周后采集標(biāo)本。

1.6 樣本采集及觀察指標(biāo)

1.6.1 樣本采集 處死小鼠前禁食、不禁水12 h，次日上午稱重，水合氯醛(0.05 mL/10 g)麻醉小鼠，用手術(shù)剪刀剪開小鼠右側(cè)后膝關(guān)節(jié)皮膚，取小鼠右側(cè)后膝關(guān)節(jié)軟骨，錫箔紙包裹好，并置于液氮中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)4組小鼠軟骨組織內(nèi)Zn2+表達(dá) 取小鼠脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨組織制備10 μm冰凍切片，置于 PBS 溶液中洗滌，在一抗(Zn2+)、二抗溶液中完成孵育后，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi) Zn2+表達(dá)。

1.6.3 RT-qPCR檢測(cè)4組小鼠軟骨組織內(nèi)的ZIP8、ZNT9、MTF1、Mt1、Mt2基因表達(dá) 用液氮將小鼠軟骨組織研磨成粉末狀，提取RNA，檢測(cè)RNA溶度，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，β-actin作為歸一化內(nèi)參基因。PCR引物序列見下表，引物由上海生工生物合成(表1)。

表1 PCR引物序列

1.6.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)4組小鼠軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、Mts蛋白表達(dá) 用液氮將小鼠關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行充分研磨，加入RIPA裂解液，冰上勻漿，應(yīng)用高速冷凍離心機(jī)對(duì)樣本進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心半徑15 cm，時(shí)間5 min，收集上清液。應(yīng)用BCA法檢測(cè)軟骨總蛋白濃度。各孔取20 μg蛋白上樣，200 V電泳進(jìn)行蛋白分離，PVDF膜100 V濕轉(zhuǎn)。用ZIP8、ZNT9、MTF1、Mts一抗孵育，封閉過夜。二抗室溫孵育2 h。交替使用TBST和TBS洗滌PVDF膜2次，10 min/次。按ECL試劑盒說明進(jìn)行顯影拍攝。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析目的蛋白的光密度值(IOD)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度馬錢子堿對(duì)軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+表達(dá)明顯增加，經(jīng)馬錢子堿藥物干預(yù)后，馬錢子堿高、中劑量組小鼠軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+表達(dá)明顯降低，且馬錢子堿高劑量組表達(dá)更低(圖1)。

圖1 不同濃度的馬錢子堿對(duì)軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+表達(dá)的影響

2.2 4組小鼠關(guān)節(jié)軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MT1、MT2 mRNA表達(dá)比較

與空白對(duì)照組相比，模型組的ZIP8、MTF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ZNT9、MT1、MT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，馬錢子堿高劑量組和馬錢子堿中劑量組ZIP8、MTF1 mRNA相對(duì)表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ZNT9、MT1、MT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。馬錢子堿高劑量組和馬錢子堿中劑量組ZIP8、MTF1相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 4組小鼠關(guān)節(jié)軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MT1、MT2 mRNA表達(dá)比較

2.3 4組小鼠關(guān)節(jié)軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MTs蛋白表達(dá)量比較

與空白對(duì)照組相比較，模型組的ZIP8、MTF1、ZNT9蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組和模型組MTs蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，馬錢子堿高劑量組和中劑量組ZIP8、MTF1蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，ZNT9、MTs蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。馬錢子堿高劑量組ZIP8蛋白表達(dá)量高于馬錢子堿中劑量組(P<0.05)。馬錢子堿高劑量組和馬錢子堿中劑量組MTF1、ZNT9、MTs蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2、表3)。

圖2 4組小鼠關(guān)節(jié)軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MTs蛋白表達(dá)

表3 4組小鼠關(guān)節(jié)軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MTs蛋白表達(dá)量比較

3 討論

在臨床實(shí)踐中，含有馬錢子的中藥成方，例如痹祺膠囊、九分散及腰痛寧等在骨關(guān)節(jié)炎的治療中療效明顯[17-18]。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿具有抗腫瘤、抗心律失常、抗骨關(guān)節(jié)炎的作用，在骨關(guān)節(jié)炎作用尤為突出。馬錢子堿可明顯抑制軟骨細(xì)胞凋亡[19]，促進(jìn)體外培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞增殖[20]。

研究[21-23]發(fā)現(xiàn)，Zinc-ZIP8-MTF1信號(hào)通路在KOA軟骨退變中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨遭受到機(jī)械壓力損傷、炎性因子刺激等傷害時(shí)，Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP8表達(dá)水平明顯增加，介導(dǎo)細(xì)胞外Zn2+大量?jī)?nèi)流；而隨著細(xì)胞內(nèi)Zn2+水平增加，Zinc-ZIP8-MTF1信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子MTF1被激活，活化的MTF1促進(jìn)軟骨細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表達(dá)，激活分解代謝級(jí)聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)KOA軟骨病變[21-23]。

近年來研究[24-25]發(fā)現(xiàn)，Zn2+與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切。研究[25-26]發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎患者的血液和尿液中Zn2+高表達(dá)，Zn2+可作為KOA早期診斷指標(biāo)。此外，研究[27]發(fā)現(xiàn)，Zn2+在老年人的關(guān)節(jié)軟骨潮線區(qū)有特異性積累。Zn2+是人體重要的微量元素，它在細(xì)胞水平始終處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)這種動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí)，人體容易出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常、免疫功能低下及腫瘤等多種疾病[28-30]。因此，維持Zn2+的穩(wěn)態(tài)對(duì)保持細(xì)胞正常功能和機(jī)體健康具有重要意義。

Zn2+的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)主要受ZNT家族、ZIP家族、MTs及MTF1等蛋白調(diào)控[29，31]。ZNT家族主要把Zn2+從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，負(fù)責(zé)Zn2+流出。ZIP家族主要是把Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，其中與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)的是ZNT9和ZIP8。MTs主要儲(chǔ)存Zn2+，調(diào)節(jié)Zn2+表達(dá)[21]。MTF1的主要特征是激活MTs，并且在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Zn2+水平方面具有重要作用[21，28]。本研究探討了馬錢子堿對(duì)ZIP8、ZNT9、MTF1、MTS 基因和蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組中Zn2+未見表達(dá)，而模型組軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+表達(dá)明顯增加；經(jīng)馬錢子堿藥物干預(yù)后，馬錢子堿高、中劑量組小鼠軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+表達(dá)明顯降低，且馬錢子堿高劑量組Zn2+表達(dá)更低。同時(shí)，與空白對(duì)照組比較，模型組ZIP8、MTF1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。與模型組相比較，馬錢子堿高、中劑量組ZIP8、MTF1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)馬錢子堿可通過降低KOA小鼠ZIP8、MTF1 mRNA和蛋白表達(dá)，調(diào)控軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+表達(dá)，達(dá)到延緩早期KOA模型小鼠軟骨退變的作用機(jī)制。但本研究樣本不足，還需擴(kuò)大樣本進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，且本研究是以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，未來對(duì)馬錢子堿防治KOA的作用機(jī)制還需更多臨床研究。