基于LC-MS技術(shù)的二氫丹參酮Ⅰ抗肝纖維化肝臟代謝組學(xué)研究

陶朝陽，朱臻宇，邢心睿，曹 奇，王 輝 （. 西藏軍區(qū)總醫(yī)院藥物制劑研究中心，西藏 拉薩 85007；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 00433）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是以肝內(nèi)細胞外基質(zhì)（extracellular matrix protein，ECM）過度沉積和纖維瘢痕形成為特征的慢性肝病，在世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和病死率，持續(xù)發(fā)展導(dǎo)致肝硬化、肝癌的發(fā)生[1]。肝纖維化發(fā)病機制復(fù)雜，病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、膽汁淤積性肝病等均可能導(dǎo)致慢性肝炎癥，并最終導(dǎo)致肝纖維化[2]。然而，除肝移植外，目前尚無有效治療肝纖維化的方法，針對肝纖維化早期識別和治療對于預(yù)防相關(guān)負面后果至關(guān)重要。鑒于肝臟是人體最大的器官和主要代謝樞紐，探討肝纖維化的代謝特征有望發(fā)現(xiàn)新的標志物和治療靶點。

二氫丹參酮Ⅰ（dihydrotanshinone I，DHI）是中藥丹參中的親脂性成分，被認為是一種潛在的治療肝纖維化的藥物，其肝臟保護作用、抗癌作用、抗流感活性、抗炎作用等生物學(xué)功能已多次報道[3-5]。在本課題組前期扶正化瘀方抗肝纖維化機制研究中發(fā)現(xiàn)DHI是扶正化瘀膠囊的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也在細胞活性實驗中證明其能顯著抑制細胞活性發(fā)揮抗肝纖維化作用[6]。然而，DHI對肝纖維化治療作用的體內(nèi)藥效及機制尚不明確。本研究利用肝臟代謝組學(xué)方法研究肝纖維化密切相關(guān)的生物標志物，探索肝纖維化相關(guān)病理過程，同時采用DHI進行干預(yù)，研究其對肝纖維化的治療作用及作用機制，為肝纖維化早期診斷、有效治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

METTLER AE240 型電子天平（瑞士梅特勒公司）；FRESCO17臺式冷凍離心機 (Thermo Fisher，美國)；DZG-6020真空干燥箱 (上海益恒實驗儀器公司)；Agilent 1290 Infinity 液相色譜儀、Agilent 6538 Q-TOF/MS 質(zhì)譜儀、Micro17高速離心機（Thermo Fisher Scientific，美國）；HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，2.5μm）(Waters，美國)。

1.2 試藥

DHI（純度 98%，上海一飛生物科技有限公司）；硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA，東京化成工業(yè)株式會社)；甲醇、乙腈（均為色譜純，德國Merck公司），甲酸（色譜純，ROE scientific INC，美國）；水為實驗室制備的超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

SD大鼠，雄性，質(zhì)量(200～250 g)，共28只，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，合格證號：SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，遵循動物實驗的標準操作規(guī)范。飼養(yǎng)條件：溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%，12 h晝夜交替循環(huán)的條件下籠養(yǎng)。

2 方法

2.1 動物模型的構(gòu)建和治療

將28只雄性SD大鼠隨機分為4組：正常組、肝纖維化模型組、DHI低劑量組和DHI高劑量組，每組7只。24 h適應(yīng)性飼養(yǎng)后，除正常組外，模型組及不同用藥劑量干預(yù)組每周3次腹腔注射200 mg/kg TAA，持續(xù)給TAA造模8周；同時，自第5周起，按照給藥劑量持續(xù)給藥4周：正常組、模型組，每日給予生理鹽水10 ml/kg；DHI低劑量組，每日給予DHI15 mg/kg；DHI高劑量組，每日給予30 mg/kg。

2.2 樣品收集

最后一次給藥24 h后，采用脊椎脫臼法處死大鼠?？焖偾谐闻K后，用0 ℃生理鹽水沖洗并立即放于液氮中快速冷凍，儲存于-80 ℃冰箱直至分析。

2.3 樣品制備

將凍存的肝臟組織置于室溫自然解凍，取約100 mg肝臟樣本于勻漿管中，加入800μl甲醇，在60 Hz下充分勻漿至沒有纖維顆粒，4 ℃離心15 min（14 500×g）后取上清液置于1.5 ml的離心管中，氮氣吹干。在上述氮氣吹干的樣品殘渣中加入300 μl含內(nèi)標甲醇渦旋30 s（內(nèi)標為L-2-氯苯丙氨酸，濃度為5 μg/ml），每個樣品取10μl混勻作為質(zhì)量控制樣品。

2.4 LC-MS分析

色譜條件：Agilent 1 290 Infinity UHPLC，色譜柱：Waters XSelect HSS T3 column色譜柱，柱溫：30 ℃；進樣量：3 μl；流動相A：含0.1 %甲酸的水，流動相B：含0.1 %甲酸的乙腈。流速：0.4 ml/min；梯度洗脫條件：0～2 min，2 %B，2～17 min，2 %～98 % B，17～19 min，98 %B。質(zhì)譜條件：Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF/MS，離子源：電噴霧（ESI）離子源，正、負離子檢測模式；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣體流量：11 L/min；碎裂電壓：120 V；毛細管電壓：4 000 V（ESI+）/3 500 V（ESI-）；質(zhì)譜掃描范圍：50～1 500m/z。

2.5 數(shù)據(jù)分析

2.5.1 數(shù)據(jù)處理

將采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzData格式文件，然后通過R軟件XCMS程序?qū)①|(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為含有保留時間、質(zhì)核比、峰強度的數(shù)據(jù)矩陣。保留頻數(shù)超過80%的質(zhì)核比數(shù)據(jù)，并對所有峰面積以內(nèi)標峰面積和肝組織質(zhì)量進行歸一化處理。

2.5.2 差異代謝物篩選

將上述獲得的二維矩陣列表導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中進行多元統(tǒng)計分析，采用正交偏最小二乘判別分析研究各組間差異，并得到變量VIP值。正常組和模型組組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用VIP＞1，且選擇差異具有顯著性（P＜0.05）的變量作為潛在的差異代謝物，然后檢索數(shù)據(jù)庫（HMDB、METLIN、KEGG數(shù)據(jù)庫），篩選出潛在的差異代謝物。

2.5.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA），兩組樣本分析采用獨立樣本t檢驗，分析數(shù)據(jù)差異的統(tǒng)計學(xué)意義，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 基于LC-MS的肝組織代謝輪廓分析

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS在正、負兩種模式下對肝組織進行代謝組學(xué)分析，兩種模式下典型的總離子流圖見圖1。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性對研究的可靠性非常重要，為考察實驗的系統(tǒng)穩(wěn)定性，本研究從每個肝組織樣品中取10 μl混勻后作為質(zhì)量控制樣品。在樣品序列一開始連續(xù)進樣10針QC樣品，并按每7個樣品再進樣一針，共進樣14次。正、負離子模式下，QC樣品均顯示良好的聚集狀況，證明該分析系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。

圖1 肝臟正負離子模式下典型的LC-MS總離子流圖

3.2 多變量統(tǒng)計分析

經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后，LC-MS數(shù)據(jù)集在正離子模式下得到368個離子，在負離子模式下得到249個離子。根據(jù)OPLS-DA方法對數(shù)據(jù)進行分析，OPLSDA是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，最大特點是可以去除自變量和分類變量無關(guān)的分類變異，根據(jù)得分圖可以揭示數(shù)據(jù)離散程度，發(fā)現(xiàn)異常值[7]。在得分圖上具有相似的代謝物組成的樣本，處在比較相似的位置，樣本間距越遠代表代謝物差異越大，樣本間生理狀態(tài)相差越大。將正常組、模型組、DHI低劑量組和DHI高劑量組的LCMS數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SIMCA進行分析，其得分如圖2A、2B所示，正常組與模型組樣本各自聚為一類，并且完全分離，說明肝纖維化大鼠模型的肝組織代謝輪廓發(fā)生顯著改變，代謝物的種類或水平發(fā)生了明顯變化。DHI給藥組（DHI低劑量組、DHI高劑量組）能夠與模型組明顯區(qū)分，并向正常組靠近，表明DHI給藥組可恢復(fù)部分代謝物至正常水平。

圖2 基于LC-MS正負離子模式下的OPLS-DA分析得分圖

3.3 差異代謝物的篩選

OPLS-DA可用于尋找導(dǎo)致聚類間顯著差異的變量，篩選正常組和肝纖維化大鼠模型組間潛在的差異代謝物?；贠PLS-DA模式下VIP＞1篩選兩組間的差異代謝物，進行t檢驗后，篩出模型組和正常組間差異具有顯著性的變量（P＜0.05）。基于VIP和t檢驗以及HMDB和KEGG等數(shù)據(jù)庫比對，篩選出38個與TAA誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型相關(guān)的較為重要的差異代謝物作為潛在生物標志物（表1）。通過KEGG、HMDB等數(shù)據(jù)庫查詢，我們發(fā)現(xiàn)這些代謝物主要涉及谷胱甘肽代謝、褪黑素代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)等途徑。

表1 TAA誘導(dǎo)肝纖維化相關(guān)的差異代謝物及其代謝通路

3.4 DHI的干預(yù)治療

以肝纖維化相關(guān)的差異代謝物的相對含量作為檢測指標可以評價DHI對肝纖維化的治療作用，比較發(fā)現(xiàn)33種代謝物的含量發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn)（圖3），同時，有14種代謝物的含量回調(diào)與DHI的劑量成正相關(guān)性，即高劑量組比低劑量組回調(diào)更多（圖3A、3B）。

圖3 33種潛在標志物在正常組、肝纖維化模型組、DHI給藥組中的相對含量變化

4 討論

4.1 研究意義

肝纖維化是一種發(fā)病機制復(fù)雜，可導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭甚至肝癌等嚴重肝臟疾病的慢性流行肝病，然而目前并沒有藥物可以治療肝纖維化，中藥及其活性成分由于其多靶點、多通路等特點被認為是肝纖維化治療的潛在藥物。代謝組學(xué)可以對生物體內(nèi)小分子代謝產(chǎn)物進行動態(tài)分析，通過分析闡述代謝物與生理病理變化間的聯(lián)系，對肝纖維化的機制進一步闡述，也能通過肝纖維化相關(guān)差異代謝物的含量相對變化分析藥物對肝纖維化模型的藥效作用。本研究用肝臟代謝組學(xué)方法分析了與TAA誘導(dǎo)的肝纖維化模型密切相關(guān)的38種代謝物，主要涉及谷胱甘肽代謝、褪黑素代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)等途徑，DHI能夠通過調(diào)節(jié)部分代謝通路發(fā)揮預(yù)防和治療肝纖維化作用。

4.2 谷胱甘肽代謝

肝纖維化的產(chǎn)生伴隨著肝細胞死亡和肝星狀細胞(HSCs)的活化，HSCs約占正常人肝臟中非實質(zhì)細胞的1/3和總駐留細胞的15%，HSCs從靜態(tài)到激活會使得ECM過剩表達而導(dǎo)致纖維化，而氧化應(yīng)激在HSCs激活和ECM形成中發(fā)揮重要的促進作用[1,8]。谷胱甘肽（GSH）是人體內(nèi)含量最豐富的抗氧化劑，也是體內(nèi)氧化防御體系的主要組成成分之一[9]。GSH可以在谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶以及谷胱甘肽還原酶的作用下與其氧化態(tài)相互轉(zhuǎn)換，清除部分有機過氧化物，調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，緩解氧化應(yīng)激對組織造成的損傷[10-11]。有研究表明，在對乙酰氨基酚、四氯化碳、重金屬砷等誘導(dǎo)下，大鼠肝組織中GSH含量下降[12]。本研究中，TAA誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型肝組織中GSH顯著下降，這與谷胱甘肽在其他肝損模型中下調(diào)的趨勢一致。經(jīng)過DHI干預(yù)后GSH回調(diào)，且高劑量DHI比低劑量組回調(diào)比例更大，這說明DHI可能調(diào)整體內(nèi)谷胱甘肽代謝通路，通過提高體內(nèi)谷胱甘肽含量恢復(fù)肝組織抗氧化功能，緩解氧化應(yīng)激對肝臟的進一步損傷，從而起到抗肝纖維化作用。

4.3 褪黑素代謝

肝纖維化過程中，抑制HSC的激活和增殖是預(yù)防和治療肝纖維的重要途徑。血小板衍生生長因子(PDGF)可以激活JAK2/STAT3信號通路，致使HSC增殖，并抑制HSC凋亡[13]。已有研究證明，褪黑素通過抑制JAK2/STAT3相關(guān)信號通路或抗氧化機制來抑制HSC的激活和增殖從而發(fā)揮肝臟保護作用[14-15]。在本研究中，環(huán)6-羥基褪黑素及N-乙酰血清素硫酸鹽均為褪黑素代謝產(chǎn)物，在模型組中含量顯著增加，說明褪黑素被大量代謝，肝臟保護作用被抑制。經(jīng)過DHI的干預(yù)后兩種褪黑素代謝產(chǎn)物均回調(diào)，這提示DHI可能通過調(diào)整褪黑素代謝，回調(diào)褪黑素及其代謝產(chǎn)物的機體內(nèi)含量發(fā)揮抗肝纖維化活性。

4.4 氨基酸代謝

肝臟是機體物質(zhì)代謝的中樞器官，在氨基酸的新陳代謝和蛋白質(zhì)的合成與分解中發(fā)揮重要作用。天冬氨酸是一種酸性氨基酸。天冬氨酸在哺乳動物中一般被認為是一種營養(yǎng)上非必需的氨基酸。然而，越來越多的文獻表明，天冬氨酸在包括肝臟生理學(xué)在內(nèi)的許多生物和生理過程中起著重要作用，如合成精氨酸以維持巨噬細胞應(yīng)對免疫挑戰(zhàn)，同時，也有證據(jù)表明天冬氨酸可以減輕肝損傷、增強肝臟功能[16]。本研究發(fā)現(xiàn)TAA誘導(dǎo)大鼠肝纖維化后，與正常組比較，模型組中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路被干擾，L-天冬氨酸含量顯著變化，經(jīng)過DHI的干預(yù)后回調(diào)，這提示DHI可能調(diào)整丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路，改變體內(nèi)天冬氨酸含量發(fā)揮肝保護作用。

4.5 脂質(zhì)代謝

脂質(zhì)不僅是細胞膜的組成成分，而且參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。磷脂酰膽堿、鞘脂、溶血性磷脂酰膽堿是血清脂蛋白和細胞膜的重要組成成分。溶血磷脂酰乙醇胺是磷脂酶A1水解磷脂酰乙醇胺(PE)失去一分子脂肪酸生成的產(chǎn)物，作為一種溶血卵磷脂，在肝臟中與卵磷脂一起在線粒體間進行轉(zhuǎn)移[17]。有研究證明，PE通過N-甲基轉(zhuǎn)移酶生成PC的通路約占PC產(chǎn)生量的30%，磷脂酰膽堿為肝臟重要營養(yǎng)來源，可以拮抗肝臟受病毒、藥物、酒精及其他有毒物質(zhì)的侵害，防止肝纖維化[9]。肝臟是脂質(zhì)生成和脂肪酸氧化等脂類代謝的主要場所，肝纖維化時可以引起脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運及分解代謝的普遍紊亂，而脂質(zhì)代謝異常又會加重肝損害，引起肝臟的脂毒性[18]。在本研究中，4種LysoPE在模型組中均發(fā)生下降，另外一些磷脂代謝相關(guān)物質(zhì)，如GlcCer(d18:1/12:0)、PE(16:0/P-16:0)、PE(18:0/15:0)、CL(i-13:0/i-22:0/i-12:0/i-13:0)和脂質(zhì)代謝相關(guān)物質(zhì)如二酰甘油（DG）、甘油磷酸甘油、?；撬嵝苋パ跄懰岬仍谡＝M與模型組大鼠中也存在顯著差異，說明TAA誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型脂質(zhì)代謝的紊亂。經(jīng)過DHI干預(yù)治療后，代謝物水平不同程度得到回調(diào)，表明DHI可通過干預(yù)多個脂質(zhì)代謝通路發(fā)揮其抗肝纖維化活性。

4.6 能量代謝

三羧酸循環(huán)是糖、脂肪、氨基酸三大營養(yǎng)素的最終代謝通路，在能量代謝、提供生物合成的前體中起重要作用。琥珀酸既是三羧酸循環(huán)的的重要中間產(chǎn)物，也是一種重要的細胞外信號分子，在信號傳遞、炎癥反應(yīng)、肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[19]。在本研究中，肝纖維化模型組大鼠琥珀酸的代謝變化趨勢均與正常大鼠相反，而給予DHI后趨近正常，說明DHI能夠改善肝纖維化大鼠的能量代謝。

5 結(jié)論

本研究建立了LC-MS代謝組學(xué)分析的方法，通過OPLS-DA篩選出與肝纖維化密切相關(guān)的38種差異代謝產(chǎn)物，主要涉及谷胱甘肽代謝、褪黑素代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)等途徑?；?8種差異代謝物在正常組、模型組及DHI給藥組之間相對含量的差異，對DHI預(yù)防治療大鼠肝纖維化模型的藥效進行了評價，結(jié)果表明DHI能夠回調(diào)34種潛在差異代謝物的相對含量，調(diào)節(jié)部分失衡代謝通路，發(fā)揮抗肝纖維化作用。本研究為肝纖維化的新標志物和治療靶點的發(fā)現(xiàn)以及DHI作為抗肝纖維化潛在藥物的進一步開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。