甜菜DAMD引物篩選及品種快速鑒定

丁劉慧子，邳植，吳則東

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

糖甜菜是我國北方的重要經(jīng)濟(jì)作物和糖料作物，我國甜菜集中產(chǎn)區(qū)主要分布在內(nèi)蒙古、黑龍江和新疆等地區(qū)[1]。甜菜在我國的栽培歷史只有100 多年，甜菜制糖工業(yè)和種植業(yè)的發(fā)展，在很大程度上取決于甜菜品種的質(zhì)量。目前我國的甜菜品種主要由世界上三大育種公司控制，國內(nèi)使用的甜菜種子都依靠進(jìn)口[2]。生產(chǎn)上偶爾會出現(xiàn)品種的假冒現(xiàn)象，而鑒別品種真實性的主要方法依然是形態(tài)學(xué)鑒定法。由于糖甜菜基本來源于白西里西亞這個品種[3]，其遺傳基礎(chǔ)相對較窄，遺傳差異較小，因此利用形態(tài)學(xué)方法對糖甜菜進(jìn)行鑒定非常困難，而且鑒定過程往往需要經(jīng)歷整個甜菜生長期。

分子標(biāo)記技術(shù)在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)開始應(yīng)用，它是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記技術(shù)之后發(fā)展起來的一種新型的遺傳標(biāo)記[4]。近幾十年以來，已經(jīng)有SNP[5]、EST[6]、ISSR[7-8]、RFLP[9]、RAPD[10]、AFLP[11]、SRAP[12]和SSR[13-14]等多種分子標(biāo)記技術(shù)被運(yùn)用于甜菜遺傳圖譜的構(gòu)建或遺傳多樣性分析。

DAMD 分子標(biāo)記技術(shù)（Direct amplification of minisatellite region DNA）全稱為基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的小衛(wèi)星DNA 定向擴(kuò)增[15]。小衛(wèi)星又稱超可變重復(fù)序列（HVR）或可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR），是由10～60 bp堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列，含有小衛(wèi)星的區(qū)域通常表現(xiàn)出較高水平的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）。小衛(wèi)星位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)中的極端變異被認(rèn)為是人類觀察到的多態(tài)性來源。由于小衛(wèi)星或VNTR 序列廣泛存在于不同種類的動植物中，以孟德爾的方式遺傳，并具有較高的特異性，因此，可利用小衛(wèi)星序列作為引物，采用PCR 技術(shù)擴(kuò)增到小衛(wèi)星之間的序列，用以區(qū)分不同的物種。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于石竹[16]、蘭花[17]、毛蕨[18]、絲瓜[19]等植物的多樣性分析中。本研究利用3個核心DAMD 引物對40個甜菜品種進(jìn)行鑒定，以實現(xiàn)快速鑒定甜菜品種并建立其指紋圖譜的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜菜品種名稱及品種編號如表1所示，表1 中所有甜菜品種的種子均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全國農(nóng)技中心提供，所有品種均為已經(jīng)登記的品種。40 個甜菜品種均種植于黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院試驗基地，當(dāng)甜菜長至4對真葉時采集其嫩葉用于試驗測定。

表1 40 個甜菜品種名稱及品種編號Table1 Name and number of 40 sugar beet varieties

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取

甜菜基因組DNA 的提取采用改良的CTAB法[20]，提取后利用核酸蛋白測定儀檢測提取的DNA 濃度和純度，并稀釋到10 ng/μL。

1.2.2 DAMD引物

試驗中所用的引物由上海生工生物工程有限公司合成，采用HAP方式純化。引物序列來源于文獻(xiàn)[21]。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系及程序

PCR 擴(kuò)增體系：5μL 體系中包含2×PCR Master Mix 2.5μL、模板DAN 1μL、引物0.4μL 以及1.1μL 的去離子水。

PCR 程序：采用Touchdown 程序，即94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火（65～56 ℃每降一度2 個循環(huán)）30 s，72 ℃延伸30 s。以后每個循環(huán)的退火溫度依次降低2 ℃，直到56 ℃；再94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，15個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳

PCR 產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測，電泳儀為BIORADPowerPac200。凝膠每孔點(diǎn)樣量2μL，緩沖液為0.5×TBE，恒壓180 V，電泳時間90 min。電泳結(jié)束后使用硝酸銀法進(jìn)行凝膠染色[22]。將膠放入到染色液中（180 mL蒸餾水、20 mL無水乙醇、0.4 g 硝酸銀）5 min，然后取出放入裝有100 mL蒸餾水的塑料盆中漂洗60 s，最后放入顯影液（200 mL蒸餾水、6 g氫氧化鈉、1 mL甲醛）中，直至出現(xiàn)清晰條帶，立即拍攝圖像保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Mega7.0 軟件計算品種間遺傳距離，選擇參數(shù)：Bootstrap Relications（1000）,Gaps/Missing Date（Pairwise Deletion）用于設(shè)置空位處理原則，在計算兩條序列的遺傳距離時不僅不計算兩條序列中任一條的空位位點(diǎn)，即使存在也不刪除。Codon 1st+2nd+3rd+noncoding，用于設(shè)置計算遺傳距離使用的密碼子位點(diǎn)，選擇為1～3 位和非編碼的位點(diǎn)。Model（Nucleotide:p-distances）選擇計算遺傳距離的模型即核苷酸的遺傳距離。D：Transitions+Transversion 表示同時利用轉(zhuǎn)換和顛換值來計算遺傳距離，根據(jù)計算結(jié)果建立UPGMA 聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜DNA濃度及純度測定

利用CTAB 法對40 個甜菜品種葉片進(jìn)行DNA 提取，使用Thermo 公司NanoDrop 2000/2000c 紫外分光光度計測定提取的DNA 濃度和純度。結(jié)果表明所有DNA 樣品的OD260/OD280值均在1.7～1.8，符合進(jìn)一步用于PCR擴(kuò)增的要求，可用于甜菜DAMD指紋圖譜的構(gòu)建。

2.2 DAMD 引物的篩選

每個樣品的DAMD擴(kuò)增條帶以0、1數(shù)據(jù)記錄，在相同的遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，利用降落PCR技術(shù)對適宜于甜菜基因組擴(kuò)增的DAMD引物進(jìn)行篩選，結(jié)果從29條DAMD 引物中篩選出8條核心引物，這8 條引物分別為URP1F、OGRB01、URP4R、URP13R、URP6R、URP2R、URP17R 和URP32F。篩選的引物名稱、引物序列、擴(kuò)增的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)及多態(tài)性百分比見表2。從表2可以看出，8條引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)最低7條，最多23條，8條引物共擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)為99條，擴(kuò)增總條帶數(shù)為101條，總的多態(tài)性百分比為97.22%。

表2 篩選引物的基本信息及擴(kuò)增產(chǎn)物信息Table2 The basic information and amplification product information of the selected primers

2.3 利用DAMD引物鑒別40個甜菜品種

以40個甜菜品種的DNA 為模板，從8條核心引物中隨機(jī)選取URP1F、URP6R 和URP17R這3條引物作為鑒定40 個甜菜品種的DAMD 引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，如圖1、2 和3 所示。由于DAMD 引物的多態(tài)性較高，在所用甜菜品種較少的情況下，非常適合采用特征譜帶法實現(xiàn)對甜菜品種的鑒別。特征譜帶法不需要構(gòu)建0、1數(shù)據(jù)，每個品種都有一個屬于自己的特征譜帶，因此極其方便。引物URP6R的擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示，經(jīng)過不同品種擴(kuò)增的譜帶進(jìn)行一一比對可以看出，40個泳道的擴(kuò)增條帶均不一致，即利用引物URP6R 可以將40個甜菜品種一次性全部鑒定出來。引物URP17R 的擴(kuò)增結(jié)果如圖2 所示，經(jīng)過對不同品種擴(kuò)增的譜帶進(jìn)行一一比對后發(fā)現(xiàn)，40個泳道的擴(kuò)增條帶中，除了無法鑒別15號與29 號品種以及4 號與33 號品種外，其余泳道的條帶均不一致，每個品種均具有自己獨(dú)特的帶型。引物URP1F 的擴(kuò)增結(jié)果如圖3 所示，利用特征譜帶法可看出，15 號與29號泳道的擴(kuò)增條帶不一致，4 號與33號泳道的擴(kuò)增譜帶也不相同。因此利用引物URP17R與引物URP1F組合可以將40個甜菜品種全部鑒定出來。

圖1 引物URP6R擴(kuò)增圖Fig.1 Fingerprint of primer URP6R amplification

圖2 引物URP17R擴(kuò)增圖Fig.2 Fingerprint of primer URP17R amplification

圖3 引物URP1F擴(kuò)增圖Fig.3 Fingerprint of primer URP1F amplification

2.4 UPGMA聚類分析

每個樣品的DAMD 擴(kuò)增條帶型以0、1統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)記錄庫。在相同的遷移率位置上，以有帶記為1，無帶記為0，記錄每個樣品的擴(kuò)增帶。利用Mega7.0軟件計算品種間遺傳距離，根據(jù)計算結(jié)果建立UPGMA聚類圖。由圖4可以看出，在遺傳距離為0.25時，可將40個品種分為2個類群。第I個類群為14號品種，第II個類群在遺傳距離為0.21 時，又被分為2 個亞群，II-1包括品種25 號，II-2 包括剩余的38 個品種。遺傳距離范圍為0.01～0.25，其中31 號與36 號品種最相近，遺傳距離系數(shù)為0.02。8 號與17 號及18 號與32 號也具有極高的相似性，遺傳距離系數(shù)為0.03。其中1 號和3 號與4 號和22號遺傳距離相等，都為0.05。5號和6號與7號和35號遺傳距離相等，為0.07。10號和20號與34號和38 號遺傳距離相等,為0.12。通過DAMD 引物的擴(kuò)增結(jié)果，參試品種之間均可以區(qū)分。

圖4 基于擴(kuò)增條帶計算的40個甜菜品種UPGMA聚類圖Fig.4 UPGMA cluster diagram of 40 sugar beet varieties based on amplification bands calculation

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記技術(shù)可以克服傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)標(biāo)記鑒定的一系列弊端[23]。DAMD 分子標(biāo)記具有分辨率高、多態(tài)性高、操作相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，與RFLP 技術(shù)的復(fù)雜操作相比，基于簡單PCR 的DAMD 技術(shù)更受研究者的青睞[24]。此外，DMAD 引物的反應(yīng)可在高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行，其反應(yīng)的穩(wěn)定性明顯高于RAPD[25]。與單引物的SCoT相比，單個DAMD引物中檢測到的多態(tài)位點(diǎn)遠(yuǎn)高于單個SCoT引物檢測到的多態(tài)位點(diǎn)，具有極高的多態(tài)性，與同樣具有高多態(tài)性的AFLP 技術(shù)相比，DAMD 引物沒有專利的限制，且擴(kuò)增的條帶更清晰和易于識別[26]。因此在群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析、物種進(jìn)化、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域，DAMD技術(shù)具有極高的應(yīng)用價值。

本試驗從29 條DAMD 引物中篩選出8 條擴(kuò)增條帶清晰、易于識別、多態(tài)性高的引物，可做為甜菜品種鑒定的核心引物，8 條引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)7～23，總計擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)為99 條，擴(kuò)增總條帶數(shù)為101條，多態(tài)性為97.22%。由于DAMD 引物的高多態(tài)性可以采用特征譜帶法，單獨(dú)使用引物URP6R 即可鑒別全部40個甜菜品種，引物URP1F和引物URP17R共同使用也可以鑒別40個甜菜品種。同時根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物建立0、1 數(shù)據(jù)庫計算出品種間遺傳距離范圍為0.01～0.25，在遺傳距離為0.25 時，可將40 個品種分為2 個類群。類群之下可分成多個亞群，通過遺傳距離建立的聚類圖也可將甜菜品種逐一鑒別。從試驗結(jié)果看，每一個DAMD 引物單獨(dú)使用都可以鑒別十到幾十個品種，如果8 條引物同時使用，理論上可以鑒別幾百個品種，DAMD擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型豐富，因此在構(gòu)建完成每個品種的特征譜帶后，只需要利用譜帶進(jìn)行對照就可以實現(xiàn)對甜菜品種的鑒別，極其方便快捷。DAMD 的高多態(tài)性為高效快速鑒定甜菜品種提供了可能，同時利用Mega 進(jìn)行聚類分析可以進(jìn)一步分析甜菜品種的遺傳多樣性。本試驗研究結(jié)果表明DAMD 技術(shù)適用于甜菜品種鑒定，并且表現(xiàn)出了優(yōu)秀的多態(tài)性和鑒別力，在建立快速鑒別甜菜品種，分析品種遺傳信息等方面具有良好的應(yīng)用前景，可避免甜菜種植以及育種過程中出現(xiàn)甜菜品種混雜、種子純度不足及產(chǎn)量下降等一系列的問題，避免相似品種育種低效化，在很大程度上可以保護(hù)育種家與種植者的利益。