一漢族先天性核型白內(nèi)障家系的基因突變研究

李靖巖

（沈陽醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034）

0 引言

先天性白內(nèi)障為一種常見的視力缺陷疾病，多見于嬰幼兒，指出生一年內(nèi)出現(xiàn)的晶體混濁，可引起視力損傷，嚴(yán)重者或失明。該疾病臨床分型復(fù)雜,根據(jù)晶體渾濁形態(tài)、部位的不同可分為前極性白內(nèi)障、后極性白內(nèi)障、全白內(nèi)障、粉塵狀白內(nèi)障及板層白內(nèi)障等。在所有白內(nèi)障病例中，約1/3可遺傳,其中常染色體顯性遺傳（AD）為最常見的遺傳方式，也可見常染色體隱性遺傳（AR），少數(shù)為X連鎖隱性遺傳。遺傳性先天性白內(nèi)障的致病基因復(fù)雜多樣，具有明顯的遺傳異質(zhì)性。目前研究與報道證實該病與80余個基因相關(guān)：如編碼晶狀體蛋白的CRYAA、CRYBB1-3、CRYBA1、CRYGC、CRYGD等 基 因[1-5]；編碼縫隙連接蛋白的GJA3、GJA8等基因[6-7]；編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因PITX3、PAX6等[8-9]，且新的致病基因不斷被篩選出來。本研究對一個先天性核型白內(nèi)障核心家系進(jìn)行了基因捕獲測序,發(fā)現(xiàn)在家系所有患者均攜帶一晶狀體蛋白基因突變(CRYAB c.59C>G,p.P20R),為該家系的致病突變。

1 材料與方法

1.1 家系材料

家系先證者為男性，17歲，2016年2月初因視力模糊到沈陽市第四人民醫(yī)院眼科就診，臨床診斷為先天性核型白內(nèi)障,2周后內(nèi)進(jìn)行人工晶體植入術(shù)，現(xiàn)視力恢復(fù)?；颊呒议L口述該患兒幼年發(fā)病，1歲發(fā)現(xiàn)患兒視物不清，癥狀隨年齡增長逐年加重。該患者有一雙胞胎弟弟，癥狀與發(fā)病年齡相似。家系中患兒的母親早期也表現(xiàn)為類似眼部癥狀，已接受人工晶體置換手術(shù)?；純焊赣H未發(fā)現(xiàn)眼部異常癥狀和體征。本研究所涉及所有家系成員外周靜脈血抽取及DNA樣本提取已獲學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理管理委員會簽署批準(zhǔn)意見,且已獲得全體家系成員簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑

采用美國Qiagen 公司生產(chǎn)的血樣DNA提取試劑盒從外周血中提取基因組DNA。用于一代測序驗證所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，包裝液濃度為100 μmol/L，十倍稀釋成工作液，濃度為10 μmol/L。dNTP 混合液（4種堿基各2.5mmol/L）為大連寶生物公司生產(chǎn)。DNA聚合酶及配套反應(yīng)緩沖液購自大連寶生物公司：TaKaRa rTaq（5 U/μl），配套使用10×PCR Buffer（Mg2+Plus）。

1.3 基因突變篩查

查閱OMIM（http://www.omim.org/）及Pubmed最新文獻(xiàn)報道，確定81個單純性及綜合征性先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子及側(cè)翼20bp序列和轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)為目的捕獲區(qū)域，提交Life Technologies 公司進(jìn)行引物設(shè)計。81個單純性及綜合征性先天性白內(nèi)障相關(guān)基因見表1。

表1 先天性白內(nèi)障高通量測序Panel基因列表

1.4 觀察指標(biāo)

根據(jù)Life Technologies公司回報的可疑基因突變位點進(jìn)行分析，利用NCBI基因數(shù)據(jù)庫比對并排除SNP可能性后,初步確定該家系致病基因突變，并針對該突變位點設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，對該核心家系中所有成員和100位正常人DNA樣本進(jìn)行包含突變位點基因短序列的PCR擴(kuò)增，隨后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger DNA測序驗證,判斷突變與家系表型是否共分離。利用人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）查詢檢測到的致病基因突變是否為已報道突變或全新突變位點。

1.5 分析軟件及常用數(shù)據(jù)庫

1.5.1 基因組序列信息數(shù)據(jù)庫

NCBI database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），UCSC Genome（http://www.genome.ucsc.edu/）

1.5.2 引物設(shè)計軟件

Primer Premier 6.0

1.5.3 DNA測序峰圖查看軟件

Chromas 2.0

1.5.4 已報道疾病相關(guān)基因突變數(shù)據(jù)庫

The Human Gene Mutation Database（HGMD）(http://www.hgmd.cf.ac.uk/)，Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）(http://www.omim.org/)。

2 結(jié)果

Ion AmpliseqTM 二代測序發(fā)現(xiàn)，家系中兩個患兒及患兒母親的DNA樣本在CRYAB基因1號外顯子第59位堿基均發(fā)生了C>G雜合突變（圖1）,導(dǎo)致該基因編碼的αB晶體蛋白第20位氨基酸殘基由精氨酸取代了原有的脯氨酸，家系中表型正常的患兒父親和100例表型正常對照者中均未有該突變檢出。另外,在NCBI、UCSC等相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)存在相同的SNP，排出了單核苷酸多態(tài)性可能。通過查詢?nèi)祟惢蛲蛔償?shù)據(jù)庫（HGMD）證實，該點突變?yōu)橐褕蟮劳蛔?，可?dǎo)致不同臨床類型的先天性白內(nèi)障的發(fā)生。利用NCBI基因數(shù)據(jù)庫對該突變位點氨基酸序列的保守性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示P20位點在各物種具有高度保守性（圖2）。

圖1.家系患者CRYAB基因Sanger測序驗證結(jié)果

圖2.αB晶體蛋白在P20位點的氨基酸序列高度保守

3 討論

晶體蛋白主要包括α、β、γ三類，編碼晶體蛋白的基因主要有CRYAA、CRYAB、CRYBA1-4、CRYCC、CRYDD、CRYGA、CRYGB、CRYGC、CRYGD等。晶體蛋白基因突變不僅導(dǎo)致其編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)異常,還會降低晶體蛋白的溶解性而導(dǎo)致晶體混濁。

Liu等[10]在2006年報道，P20S突變可導(dǎo)致先天性后極性白內(nèi)障。αB晶體蛋白是晶狀體中重要的蛋白組分，屬熱休克蛋白，是從低等生物如細(xì)菌，到高等哺乳動物普遍存在的一種熱應(yīng)激性蛋白。機(jī)體處于高溫時，機(jī)體會被激發(fā)合成此種蛋白。許多熱休克蛋白具有分子伴侶作用，可指導(dǎo)與協(xié)助晶體蛋白空間構(gòu)像的正確折疊。αB晶體蛋白突變還可能影響其與αA晶體蛋白相互作用，從而引起顯性負(fù)效應(yīng)，導(dǎo)致患兒在晶體發(fā)育早期形成白內(nèi)障。另外，αB晶體蛋白突變還可導(dǎo)致其抑制晶體上皮細(xì)胞凋亡功能受損,從而導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。

本研究中發(fā)現(xiàn)的錯義突變位于CRYAB基因，該基因編碼αB晶體蛋白，位于11號染色體，D11S4176-D11S908區(qū)域，含3個外顯子。αB晶體蛋白一級結(jié)構(gòu)全長175個氨基酸，其中P20位點在各物種間高度保守,表明該位點編碼的氨基酸在維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)像和功能方面具有重要意義。

由于αB晶體蛋白與αA晶體蛋白可相互作用，所以我們推測，攜帶P20S突變的αB晶體蛋白可能以顯性負(fù)效應(yīng)的方式作用干擾αA晶體蛋白，從而導(dǎo)致攜帶該突變的患者在胚胎發(fā)育早期發(fā)生晶體蛋白排列干擾，進(jìn)而導(dǎo)致晶體透明度下降。另外，突變α晶體蛋白不再具有調(diào)控晶體上皮細(xì)胞凋亡的功能，導(dǎo)致晶體上皮細(xì)胞正確排列受到干擾，引起晶體透明度的下降。Li H等的報告也證實了白內(nèi)障引起P20S突變αB晶體蛋白對其伴侶活性的影響α晶體蛋白與人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[11]。近期研究表明，P20S突變導(dǎo)致了αB晶體蛋白一級結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響該蛋白的二級空間結(jié)構(gòu)，可增加α-螺旋和減少β-片層結(jié)構(gòu)，同時三級結(jié)構(gòu)也可發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性和空間構(gòu)象，誘導(dǎo)聚集體的形成[12]。我們推測，P20R突變還可能改變了該蛋白的親水性和等電點，導(dǎo)致突變蛋白的溶解度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)自聚集，并引發(fā)更穩(wěn)定的αA晶體蛋白雜合多聚體。此外，該突變還可能影響到αA晶體蛋白的分子伴侶功能，從而進(jìn)一步促進(jìn)患者白內(nèi)障的發(fā)展。

本研究采用的基因突變篩查技術(shù)主要為基于illumina平臺的二代測序技術(shù)。第二代DNA測序技術(shù)是對第一代測序技術(shù)的劃時代變革。第一代測序技術(shù)具有高達(dá)99.999% 的準(zhǔn)確率，但不足之處是測試速度慢、通量低、成本高昂等。以往的致病基因連鎖分析及一代DNA測序策略在面對大量的患者DNA樣本或遺傳規(guī)律復(fù)雜、致病基因譜巨大的突變基因篩查工作時，往往無法在短時間內(nèi)得到有效、精確、科學(xué)的實驗結(jié)果。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，第二代DNA測序技術(shù)，又被稱為高通量測序技術(shù)，以低成本、高準(zhǔn)確度、高通量等優(yōu)勢成為先天性基因突變篩查的主流技術(shù)，特別適用于致病基因譜龐大、遺傳規(guī)律復(fù)雜的先天性遺傳病的致病基因突變篩查。

目前，DNA分子測序技術(shù)又迎來了第三代，發(fā)明人是Stephen W Turner博士和Jonas Korlach博士。測序技術(shù)經(jīng)過前面的發(fā)展，單次測序讀取長度從Sanger測序時代的1000bp，降到了高通量測序時代的幾百bp，到了三代測序技術(shù)又擁有了超長的讀取長度，通量和速度都得到了大幅提升。它彌補了前兩代測序技術(shù)中諸多缺點，如讀長短、受目標(biāo)片段GC含量影響大等局限。三代測序最大的優(yōu)勢點是可以進(jìn)行單分子測序，即實驗者在測序過程無需對測序目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第三代基因測序最大讀取長度得到了有效增加，可以大大減少拼接成本，從而節(jié)省試劑消耗和操作步驟。由于該測序技術(shù)無需PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段，因此避免了由于反復(fù)大量的DNA復(fù)制引入的堿基復(fù)制錯誤，造成假陽性實驗結(jié)果。第三代測序技術(shù)還可拓展應(yīng)用于甲基化DNA序列測序、RNA序列測序以及其他微量樣本測序等。第三代測序技術(shù)的一個亮點在于甲基化DNA序列測序。測序過程中DNA聚合酶復(fù)制四種堿基的速度是不一樣的，正常的堿基或者發(fā)生甲基化的堿基為模板，DNA聚合酶停頓的時間也是不同的。系統(tǒng)根據(jù)時間的不同，可以判斷模板的堿基是否甲基化。三代測序缺陷也具有一定缺陷，如單讀長的錯誤率偏高、為糾錯發(fā)生的重復(fù)測序增加了不必要的測序成本、對DNA聚合酶的活性有嚴(yán)格要求以及整體實驗成本較高等。

隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，我們相信層出不窮的DNA測序技術(shù)會實現(xiàn)更簡便的實驗操作，達(dá)到更精確、更快捷的實驗結(jié)果，會成為遺傳病致病基因突變篩查的有力工具。

4 結(jié)論

本研究通過對一個先天性核型白內(nèi)障核心家系DNA樣本進(jìn)行高通量測序聯(lián)合Sanger測序,發(fā)現(xiàn)CRYAB c.59C>G，p.P20R為該家系的致病突變。CRYAB基因雜合錯義突變可導(dǎo)致先天性核型白內(nèi)障的發(fā)生。