三焦針法對(duì)SAM 小鼠血腦屏障通透性的改善作用及通過RhoA/ROCK 通路的調(diào)控作用

王 煜 ,闞伯紅 ,趙 嵐 ,史慧妍 ,賈玉潔

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸科，天津 300193;2.國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300193)

阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）屬神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，AD 和帕金森綜合征等退行性疾病中均發(fā)現(xiàn)血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）透過率增強(qiáng)，而BBB 可影響物質(zhì)進(jìn)出大腦［1］。BBB 完整性對(duì)于維持大腦平衡具有重要作用，BBB 透過率增強(qiáng)導(dǎo)致生物入侵，病毒、細(xì)菌和酵母菌等微生物群透過BBB 進(jìn)入血液，感染腦部或伴有癲癇發(fā)作，影響健康［2］。電針可以減輕阿爾茨海默病患者智力障礙并提高學(xué)習(xí)記憶功能［3］，三焦針法是根據(jù)AD 本虛標(biāo)實(shí)的病理機(jī)制，通過調(diào)理三焦達(dá)到充養(yǎng)先天和治療AD 的目的［4］，但三焦針法是否影響B(tài)BB 尚不清楚。BBB 功能需要多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與，BBB 結(jié)構(gòu)發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致微血管生成異常，并伴隨影響B(tài)BB 功能蛋白變化，RhoA/Rho 相關(guān)蛋白激酶（Rho associated protein kinase，ROCK）通路在腦缺血/再灌注損傷大鼠中可被激活，導(dǎo)致血管通透性增加，導(dǎo)致水腫和破壞BBB，抑制RhoA/ROCK 通路保持BBB 的完整性［5］。本研究以SAMP8 老年癡呆小鼠為SAM 小鼠模型，探討三焦針法對(duì)SAM 小鼠BBB 通透性的影響，其機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK 通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品、試劑和儀器SAMP8 小鼠36 只，SAMR1 正常衰老小鼠12 只，雌雄各半，7 月齡，體質(zhì)量（25±2）g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院快速老化鼠繁育中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（津）2015-0003。所有小鼠于本院動(dòng)物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度25 ℃，濕度50%，噪音＜80 分貝，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣，自然光照，自由飲食和飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合3R 原則。伊文思藍(lán)溶液購(gòu)自德國(guó)CNW 公司，貨號(hào)：CFEQ-4-450207-000；一抗閉合蛋白（occludin protein，Occludin）、密封蛋白 5（claudin protein-5，Claudin-5）、閉鎖連接蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）、RhoA、ROCK 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)分別為ab167161、ab131259、ab61357、ab187026、ab45171 和ab8245。Libra200 型透射電鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss 公司；SA208 型Morris 水迷宮系統(tǒng)購(gòu)自江蘇賽昂斯生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將36 只SAMP8 小鼠隨機(jī)分為模型組、非穴位組和穴位組，每組12 只；對(duì)照組為12 只SAMR1 小鼠。各組小鼠參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［6］小鼠圖譜，由本院針灸經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師對(duì)所有小鼠進(jìn)行針灸，非穴組在與腹中線平行、過髂嵴尖端直上2 mm 處，1.5 寸毫針向下斜刺約3 mm，角度90°～180°、頻率60～120 min－1，每側(cè)各105 s；穴位組：三焦針法針刺血海穴（雙）直刺2～3 mm，大幅度（角度＞180°）、低頻率（頻率＜60 min－1）捻轉(zhuǎn)瀉法30 s，膻中、中脘、氣海和足三里（雙）直刺2～3 mm，小幅度（角度＜90°）、高頻率（頻率＞120 min－1）捻轉(zhuǎn)瀉法30 s；每日1 次，連續(xù)6 d、第7 天休息，連續(xù)干預(yù)4 周；對(duì)照組為SAMR1 正常衰老小鼠12 只，對(duì)照組和模型組小鼠正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行處理。

1.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能按參考文獻(xiàn)［7］對(duì)小鼠進(jìn)行適應(yīng)訓(xùn)練，操作方法：黑色內(nèi)壁不銹鋼水池（直徑150 cm、深40 cm），水池上方與計(jì)算機(jī)攝像頭相連，水池平均分成4 個(gè)象限，第一象限中央放黑色圓形逃生平臺(tái)（直徑14 cm，高29 cm），水池中注入超過平臺(tái)1～2 cm 的水，水溫（23±2）℃。第1 天所有小鼠在水中適應(yīng)1 min，觀察小鼠游泳速度和泳姿，剔除在水中不動(dòng)或打轉(zhuǎn)、出現(xiàn)明顯劃水障礙的小鼠，更換合格小鼠。第2～7 天進(jìn)行Morris 水迷宮適應(yīng)訓(xùn)練。定位航行實(shí)驗(yàn)：小鼠面朝池壁隨機(jī)從4 個(gè)象限之一放入水中，記錄小鼠找到逃生平臺(tái)時(shí)間（逃避潛伏期）；若60 s 內(nèi)未找到，則引導(dǎo)其找到平臺(tái)，停留20 s，每天訓(xùn)練4 次，連續(xù)訓(xùn)練觀察6 d?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h 撤去水下平臺(tái)，除第1 象限外隨機(jī)選取一個(gè)象限，將小鼠面朝池壁投入池中，記錄其自由游泳60 s 在原平臺(tái)所在區(qū)域的停留時(shí)間（空間探索時(shí)間）。

1.4 伊文思藍(lán)染色法檢測(cè)各組小鼠腦組織中伊文思藍(lán)含量Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取6 只小鼠進(jìn)行伊文思藍(lán)實(shí)驗(yàn)。小鼠處死前2 h 進(jìn)行腹腔麻醉，尾靜脈注射2% 4 mL·kg－1伊文思藍(lán)溶液，小鼠皮膚和四肢變藍(lán)表明注入成功。斷頭取腦并稱質(zhì)量，加入5 mL 甲酰胺溶液，54 ℃恒溫孵育24 h，14 000 r·min－1離心20 min，取上清，酶標(biāo)儀在630 nm 處檢測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算小鼠腦組織中伊文思藍(lán)含量。

1.5 透射電鏡下觀察小鼠BBB 超微結(jié)構(gòu)每組剩余6 只小鼠腹腔麻醉后立即處死，左側(cè)海馬組織置于2.5%戊二醛和1%鋨酸固定，右側(cè)海馬組織置于－80 ℃冰箱保存。固定后的海馬組織，經(jīng)丙酮逐級(jí)脫水，包埋劑包埋后制成超薄切片（厚度為50 nm），醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察BBB 超微結(jié)構(gòu)。

1.6 蛋白免疫印跡檢測(cè)小鼠海馬組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋白表達(dá)水平－80 ℃冰箱取出部分海馬組織，添加蛋白裂解液冰上研磨后提取海馬組織總蛋白，凝膠電泳分離蛋白、PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，清 洗PVDF 膜，加入對(duì)應(yīng)一抗Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA、ROCK 和GAPDH，置于4 ℃孵育過夜；加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照和定量分析。以β-actin 作為內(nèi)參照，計(jì)算各蛋白條帶灰度值與β-actin 蛋白條帶灰度值的百分比，作為蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠逃避潛伏期和空間探索時(shí)間，腦組織中伊文思藍(lán)含量，海馬組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋 白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能與對(duì)照組比較，模型組和非穴位組小鼠逃避潛伏期增加（P＜0.05），空間探索時(shí)間減少（P＜0.05），穴位組小鼠逃避潛伏期增加（P＜0.05）；與模型組和非穴位組比較，穴位組小鼠逃避潛伏期減少（P＜0.05），空間探索時(shí)間增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期和空間探索時(shí)間Tab.1 Escape latencies and space exploration times of mice in various groups (n=12，,t/s)

表1 各組小鼠逃避潛伏期和空間探索時(shí)間Tab.1 Escape latencies and space exploration times of mice in various groups (n=12，,t/s)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with non-acupoint group.

2.2 各組小鼠腦組織中伊文思藍(lán)含量對(duì)照組、模型組、非穴位組和穴位組腦組織中伊文思藍(lán)含量分別為（3.10±0.42）μg·g－1、（8.96±1.11）μg·g－1、（9.08±0.86）μg·g－1和（4.79±0.43）μg·g－1。與對(duì)照組比較，模型組、非穴位組和穴位組小鼠腦組織中伊文思藍(lán)含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位組比較，穴位組小鼠腦組織中伊文思藍(lán)含量明顯減少（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠BBB 超微結(jié)構(gòu)對(duì)照組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜完整且清晰，核仁形態(tài)規(guī)則，基底膜厚度均勻，未見血管周圍水腫情況；模型組和非穴位組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞邊界模糊，基底膜增厚，部分出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，血管水腫明顯；穴位組小鼠血管周圍水腫現(xiàn)象明顯緩解，內(nèi)皮細(xì)胞基本處于正常狀態(tài)，BBB 情況得以改善。見圖1。

2.4 各組小鼠海馬組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組和非穴位組小鼠海馬組織中Occludin、Claudin-5 和ZO-1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），RhoA 和ROCK 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），穴位組小鼠海馬組織中Claudin-5 和ZO-1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），RhoA 和ROCK 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位組比較，穴位組小鼠海馬組織中Occludin、Claudin-5 和ZO-1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），RhoA 和ROCK 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖2 和表2。

表2 各組小鼠海馬組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of Occludin,Claudin-5,ZO-1,RhoA and ROCK proteins in hippocampal tissues of mice in various groups (n=6，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with non-acupoint group.

圖2 各組小鼠海馬組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of Occludin,Claudin-5,ZO-1,RhoA,and ROCK proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

3 討論

AD 發(fā)病過程中伴有BBB 通透性增加和血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)異?，F(xiàn)象，BBB 通透性增加或促進(jìn)老年斑的加速形成［8］，造成BBB 受損；血管受損后導(dǎo)致轉(zhuǎn)入腦組織中β-淀粉樣蛋白增多，轉(zhuǎn)出腦組織的主要載體表達(dá)量減少，促進(jìn)β-淀粉樣蛋白在腦內(nèi)聚集和沉積，進(jìn)一步加重BBB［9］，β-淀粉樣蛋白的聚積與BBB 的損傷互為因果，影響AD 的發(fā)展；進(jìn)一步增加有害物質(zhì)進(jìn)入腦中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物紊亂，腦組織環(huán)境破壞，損傷神經(jīng)元［10］。本研究結(jié)果顯示：模型組小鼠逃避潛伏期和腦組織中伊文思藍(lán)含量升高，空間探索時(shí)間減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞邊界模糊，基底膜增厚，部分出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，血管水腫明顯，小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能減退，出現(xiàn)腦組織損傷，提示BBB 通透性增加，腦組織損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能減弱。

中醫(yī)AD 屬“癡呆”“善忘”范疇，腎主骨生髓，心、腦和腎等功能失調(diào)，導(dǎo)致氣血不足、腎經(jīng)失充、腦絡(luò)不通和腦髓失養(yǎng)，形成AD［11］?！峨y經(jīng)·六十六難》曰：“三焦者，原氣之別使也，主通行三氣，經(jīng)歷五臟六腑”，基本法則是梳利三焦，重在“通、化、調(diào)”，是機(jī)體體液運(yùn)行之通道，執(zhí)行了腐熟水谷、宣痛氣血津及通調(diào)水道作用，諸穴合用，使得三焦氣機(jī)條暢，同時(shí)益氣調(diào)血培補(bǔ)腎精元?dú)?、撫助人根本?2］。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，穴位組小鼠逃避潛伏期和伊文思藍(lán)含量降低，空間探索時(shí)間增加，提示經(jīng)三焦針法針刺AD小鼠后，小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能均有所提升，血管腫脹現(xiàn)象有所緩和，BBB 通透性降低。

BBB 通透性增加與多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化有關(guān)，RhoA 主要存在于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，是重要的調(diào)節(jié)激動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞形態(tài)的中介因子，RhoA 高表達(dá)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin 聚集成束，形成應(yīng)力纖維［13］；RhoA 作為重要生物信號(hào)分子，下游ROCK 是目前功能最為清楚的下游靶效應(yīng)分子，可介導(dǎo)緊密連接蛋白的重新分布，ROCK活化通過增加平滑肌中肌球蛋白輕鏈磷酸化水平和鈣離子敏感性，誘導(dǎo)內(nèi)皮屏障功能障礙，增加BBB 通透性［14-15］。BBB 的完整性受多種內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的控制，包括毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞足底、周細(xì)胞、基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)［16］。Occludin 是第1 個(gè)被確定的緊密連接蛋白跨膜蛋白，影響屏障特征、細(xì)胞遷移和增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、改變細(xì)胞通透性［17］；ZO-1 是緊密連接蛋白主要結(jié)構(gòu)蛋白，其表達(dá)量和分布情況與BBB的完整性相關(guān)［18］，Occludin 與ZO-1 相互作用調(diào)節(jié)BBB 和血管的通透性及蛋白的表達(dá)量［19］；Claudin-5 是緊密連接蛋白關(guān)鍵整合膜蛋白，調(diào)節(jié)BBB 的完整性和通透性［20］。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬組織中Occludin、Claudin-5 和ZO-1 蛋白表達(dá)水平降低，RhoA 和ROCK 蛋白表達(dá)水平升高，提示AD 小鼠海馬組織中RhoA/ROCK 通路處于激活狀態(tài)，可增加BBB通透性，表現(xiàn)在影響B(tài)BB 的緊密連接蛋白水平降低上；與模型組比較，穴位組小鼠海馬組織中Occludin、Claudin-5 和ZO-1 蛋白表達(dá)水平升高，RhoA 和ROCK 蛋白表達(dá)水平降低，提示SAM 小鼠經(jīng)三焦針法針刺后，RhoA/ROCK 通路激活狀態(tài)被抑制，緊密連接蛋白水平升高，ZO-1 充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)支架蛋白，將Occludin 和Claudin-5 錨定在細(xì)胞骨架上調(diào)節(jié)緊密連接蛋白完整性，從而改善BBB通透性。

綜上所述，三焦針法可改善SAM 小鼠所致的BBB 通透性增加現(xiàn)象，可能是通過抑制RhoA/ROCK 通路增加緊密連接蛋白實(shí)現(xiàn)的，且本研究首次驗(yàn)證三針焦法改善BBB 通透性。但影響B(tài)BB 通透性機(jī)制復(fù)雜，三針焦法亦可能通過其他通路發(fā)揮作用，發(fā)現(xiàn)新的通路也是本課題組下一步研究的重點(diǎn)。