ATP生物熒光技術(shù)在肉品生產(chǎn)在線(xiàn)清潔度監(jiān)測(cè)中的可行性研究

黃 炎，張文平，凌艷明

（1.明尼蘇達(dá)礦業(yè)制造醫(yī)用器材（上海）有限公司，上海200233；2.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東 青島266102；3.濰坊和盛園食品有限公司，山東 濰坊262127）

ATP（三磷酸腺苷）是一種化學(xué)物質(zhì)，存在于所有活生物體的細(xì)胞中，含1分子腺嘌呤、1分子核糖和3個(gè)相連的磷酸基團(tuán)構(gòu)成的高能磷酸化合物。McElroy W D[1]最早實(shí)現(xiàn)了化學(xué)能向光能的轉(zhuǎn)化。細(xì)胞受損或死亡時(shí)，其ATP值迅速下降或消失，因此ATP濃度和活細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)[2]?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)反應(yīng)[1]來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性ATP含量，反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量：

ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light

目前，多數(shù)的文獻(xiàn)圍繞醫(yī)療器械清洗效果展開(kāi)[3-5]，表明ATP可作為快速檢驗(yàn)可重復(fù)醫(yī)療器械清洗效果和醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生質(zhì)量的評(píng)價(jià)。ATP檢測(cè)技術(shù)在食品工業(yè)的多個(gè)領(lǐng)域也有采用，如脫水蔬菜和調(diào)味品的含菌量測(cè)定[6]、農(nóng)副產(chǎn)品輻照滅菌效果測(cè)定[7]、啤酒中菌落總數(shù)的快速測(cè)定[8]、肉制品新鮮度快速測(cè)定[9]等。

食品加工過(guò)程需要對(duì)清洗效果進(jìn)行判讀，主要有感官判斷、微生物培養(yǎng)和ATP生物熒光檢測(cè)。但利用涂抹工具與平板培養(yǎng)法共用的方法來(lái)檢測(cè)表面的微生物不能滿(mǎn)足食品生產(chǎn)環(huán)境實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（HACCP）管理要求。ATP生物熒光檢測(cè)方法較瓊脂培養(yǎng)法具有靈敏度高、無(wú)需大量人員、無(wú)需額外的準(zhǔn)備、收尾工作及操作簡(jiǎn)便、需要時(shí)間短等特點(diǎn)[10]。國(guó)內(nèi)外已有部分文獻(xiàn)論述ATP生物熒光檢測(cè)法與瓊脂平板計(jì)數(shù)法存在相關(guān)性，但對(duì)于肉品加工環(huán)境的應(yīng)用效果和經(jīng)濟(jì)效益并無(wú)論述，試驗(yàn)采用ATP生物熒光檢測(cè)法與瓊脂平板計(jì)數(shù)法對(duì)肉品加工環(huán)境下的人員手部清潔度和設(shè)備實(shí)施清潔度的情況進(jìn)行對(duì)比評(píng)估，預(yù)期兩者存在一定的相關(guān)性，為肉品行業(yè)在線(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器

3MTMClean TraceTM熒光檢測(cè)儀（LM1）、3MTMClean TraceTM表面ATP涂抹棒（UXL 100）、無(wú)菌棉拭紙棒、一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿、刻度吸管、刻度試管、高溫高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。

1.2 取樣點(diǎn)

某車(chē)間生產(chǎn)環(huán)境位點(diǎn)7個(gè)及員工手部。

1.3 現(xiàn)場(chǎng)采樣方法

1.3.1 ATP生物熒光檢測(cè)的采樣方法

取出冷藏于冰箱內(nèi)的包裝袋在室溫下放置10 min后，從3MTMClean TraceTM表面ATP涂抹棒中取出采樣棒，對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行充分涂抹。

1.3.2 ATP生物熒光檢測(cè)的檢測(cè)方法

涂抹后，采樣棒插入裝置，用力向下推壓藍(lán)色手柄使采樣棒充分插入，并迅速振蕩涂抹棒5 s以激活和混合反應(yīng)體系。打開(kāi)3MTMClean TraceTM熒光檢測(cè)儀樣品蓋，將激活后的涂抹棒插入裝置中，點(diǎn)擊儀器屏幕上的檢測(cè)按鈕，開(kāi)始檢測(cè)，10 s后判讀RLU結(jié)果。

1.3.3 微生物涂抹的采樣方法

用浸有無(wú)菌生理鹽水的棉拭紙棒對(duì)同一位點(diǎn)進(jìn)行充分涂抹后，將接觸部分折斷，剩余棉拭紙棒放入盛有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行稀釋、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。

1.3.4 微生物涂抹的檢測(cè)方法

將試管振蕩后，吸取1 mL原液加入盛有9 mL的無(wú)菌生理鹽水試管中，稀釋成1∶10的稀釋液，再吸取1∶10稀釋液加入到9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶100的稀釋液。在上述稀釋度中各取1 mL加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，然后傾注15~20 mL無(wú)菌菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基到無(wú)菌平皿中，并旋轉(zhuǎn)平皿，使菌懸液和瓊脂進(jìn)行充分混勻。待瓊脂冷卻凝固后，倒置平皿，底部朝上，置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)。

1.3.5 微生物計(jì)數(shù)方法

培養(yǎng)到時(shí)間后，計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù)。按照GB 4789.2中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行判讀、計(jì)算和結(jié)果報(bào)告。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)行SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分別分析RLU的對(duì)數(shù)值和菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)線(xiàn)性相關(guān)分析和線(xiàn)性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 洗手后菌落總數(shù)和熒光值檢測(cè)結(jié)果

員工洗手后ATP生物熒光法和瓊脂法的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 員工洗手后ATP生物熒光法和瓊脂法的檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，RLU值和菌落總數(shù)結(jié)果呈一定的線(xiàn)性關(guān)系。以RLU值的對(duì)數(shù)值為X軸，菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為Y軸，作散點(diǎn)圖（圖1），作統(tǒng)計(jì)學(xué)線(xiàn)性分析得出回歸方程Y=1.286 4X-3.024 4，R2=0.930 8，p<0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也就是說(shuō)，兩者具有線(xiàn)性回歸關(guān)系，說(shuō)明對(duì)于員工手部清洗效果用RLU值可以預(yù)測(cè)菌落總數(shù)結(jié)果，及時(shí)反饋手部清洗消毒后效果。

手部清洗后RLU對(duì)數(shù)值與菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的線(xiàn)性關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 手部清洗后RLU對(duì)數(shù)值與菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的線(xiàn)性關(guān)系

2.2 設(shè)備表面菌落總數(shù)和熒光值檢測(cè)結(jié)果

設(shè)備表面一共采集了105個(gè)樣本，其中73個(gè)樣本在結(jié)果判定中完全一致（2種方法同時(shí)小于限值或同時(shí)大于限值的檢樣數(shù)），23個(gè)樣本ATP涂抹結(jié)果超標(biāo)而微生物涂抹合格，5個(gè)樣本微生物涂抹超標(biāo)而ATP涂抹結(jié)果合格。清洗消毒后，將微生物結(jié)果有意義的39個(gè)環(huán)境表面涂抹的結(jié)果（ATP熒光值和微生物結(jié)果）進(jìn)行對(duì)數(shù)值轉(zhuǎn)換，以RLU值的對(duì)數(shù)值為X軸，菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為Y軸，作散點(diǎn)圖（圖2），作統(tǒng)計(jì)學(xué)線(xiàn)性分析得出回歸方程Y=0.337 4X+0.905 4，p<0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也就是說(shuō)，兩者具有線(xiàn)性正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明熒光值越高，微生物的風(fēng)險(xiǎn)越高。

設(shè)備清洗后RLU對(duì)數(shù)值與菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的線(xiàn)性關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 設(shè)備清洗后RLU對(duì)數(shù)值與菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的線(xiàn)性關(guān)系

2.3 ATP在車(chē)間環(huán)境應(yīng)用的可行性結(jié)果

假設(shè)傳統(tǒng)方法檢測(cè)一個(gè)樣品的材料費(fèi)為3元，ATP檢測(cè)一個(gè)樣品的材料費(fèi)為18元。傳統(tǒng)方法需要2個(gè)人工進(jìn)行操作，人工成本為3 000元/月；而ATP方法需要現(xiàn)場(chǎng)質(zhì)量操作工隨時(shí)操作，免去額外的人工成本。對(duì)于傳統(tǒng)方法還需要制備培養(yǎng)基所需的洗刷滅菌等操作帶來(lái)的水電費(fèi)用，為300元/月。ATP檢測(cè)儀的折舊費(fèi)定為2 000元/年。假設(shè)單個(gè)工廠每個(gè)月需要涂抹N個(gè)樣品，則傳統(tǒng)方法一年需要的檢測(cè)費(fèi)用為39 600+36 N。而ATP涂抹方法一年需要的檢測(cè)費(fèi)用為2 000+216 N。當(dāng)N<208個(gè)樣品時(shí)，使用ATP涂抹的成本會(huì)比傳統(tǒng)涂抹方法的成本更低。

3 結(jié)論

3.1 ATP生物熒光檢測(cè)法對(duì)手部清洗效果的評(píng)價(jià)

由圖1可知，RLU值和菌落總數(shù)值之間具有一定的正相關(guān)性，p<0.001，說(shuō)明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RLU值表征的是清洗效果，清洗質(zhì)量是消毒成功的前提，大量的文獻(xiàn)表明，消毒前對(duì)設(shè)備進(jìn)行有效清洗，可以使細(xì)菌數(shù)量和有機(jī)物明顯降低，否則會(huì)造成滅菌過(guò)程失敗[11-12]。在醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)，有較多的文獻(xiàn)表明ATP熒光檢測(cè)方法和細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)手衛(wèi)生消毒效果結(jié)果一致，且ATP生物熒光方法可以在現(xiàn)場(chǎng)直觀、快速得出結(jié)果，對(duì)醫(yī)務(wù)人員教育意義較大，提高醫(yī)務(wù)人員參與感控的積極性[5，13-14]。同樣，在食品加工環(huán)節(jié)中，人是影響食品質(zhì)量的一個(gè)重要因素，利用ATP熒光檢測(cè)方法可以在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)得出結(jié)果，提高企業(yè)所有員工參與質(zhì)量提升的主動(dòng)性。

3.2 ATP生物熒光檢測(cè)法對(duì)加工設(shè)施清潔度的評(píng)價(jià)

由圖2可知，RLU值和菌落總數(shù)之間具有一定的正相關(guān)性，p<0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。食品生產(chǎn)設(shè)施表面對(duì)食品生產(chǎn)的質(zhì)量起到非常重要的作用，特別是食品直接接觸面。劉陽(yáng)等人[15]研究表明，ATP生物熒光檢測(cè)計(jì)數(shù)測(cè)定的熒光值和物體表面的菌落總數(shù)情況存在良好的相關(guān)性，且ATP值不合格的點(diǎn)，其對(duì)應(yīng)的平板計(jì)數(shù)的結(jié)果也會(huì)不合格。在試驗(yàn)中，2種方法分別判定是否合格的一致率達(dá)到78.23%。另外，檢測(cè)點(diǎn)ATP值高，其24 h后必然大量滋生細(xì)菌而導(dǎo)致嚴(yán)重污染。目前，ATP生物熒光檢測(cè)方法雖然應(yīng)用于食品行業(yè)多年，但未有報(bào)道關(guān)于其在食品行業(yè)中的詳細(xì)評(píng)價(jià)結(jié)果。但從ATP生物熒光檢測(cè)方法在醫(yī)療器械清洗效果的評(píng)估中，可以看到ATP生物熒光檢測(cè)方法可以快速評(píng)估清洗效果，且利于提高清洗質(zhì)量[3-4]。

3.3 引入ATP生物熒光檢測(cè)法對(duì)運(yùn)營(yíng)成本的影響

有文獻(xiàn)指出，ATP生物熒光檢測(cè)技術(shù)存在一定的局限性，如耗材為一次性且價(jià)格昂貴，食品企業(yè)負(fù)擔(dān)不起[10]。如果單純從耗材角度看，ATP生物熒光檢測(cè)方法的價(jià)格的確會(huì)比平板檢測(cè)貴，但綜合樣品制備、人員配置、檢測(cè)時(shí)間等因素考慮，在一定檢測(cè)量下，ATP生物熒光檢測(cè)方法可以帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益較平板培養(yǎng)法更大。

食品工業(yè)中的ATP生物熒光檢測(cè)的內(nèi)容包括微生物和食品殘?jiān)黐16]。清洗是食品加工過(guò)程中的核心步驟，保證清洗效果可以進(jìn)一步確保消毒效果。ATP來(lái)源于活細(xì)胞，活細(xì)胞不僅存在于微生物中也存在于食品殘?jiān)?，食品殘?jiān)俏⑸镒躺闹匾獊?lái)源。因此，將ATP生物熒光檢測(cè)方法和微生物培養(yǎng)皿方法一起使用，ATP生物熒光檢測(cè)法確定清洗效果，而微生物培養(yǎng)皿方法確定消毒效果及微生物污染的種類(lèi)和來(lái)源。ATP生物熒光檢測(cè)方法是一種主動(dòng)控制污染事故發(fā)生的有效方法[17]，其優(yōu)點(diǎn)在于根據(jù)檢查結(jié)果，符合HACCP監(jiān)測(cè)要求，現(xiàn)場(chǎng)確認(rèn)污染情況并數(shù)值化，對(duì)于生產(chǎn)環(huán)節(jié)的現(xiàn)場(chǎng)處理提供了可靠的依據(jù)，提出具有說(shuō)服力的指導(dǎo)。利用軟件系統(tǒng)可以追蹤位點(diǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果變化趨勢(shì)，防患于未來(lái)。有文獻(xiàn)報(bào)道，次氯酸鹽、季銨鹽、含量1 000 mg/L過(guò)氧化氫等對(duì)ATP生物熒光法RLU值測(cè)定并沒(méi)有顯著性影響[18]；但也有文獻(xiàn)報(bào)道，乳酸、1 000 mg/L過(guò)氧化氫可降低RLU檢測(cè)值[19]。因此，加工環(huán)境中的消毒劑殘留對(duì)清潔度快速檢測(cè)是否有影響，需要進(jìn)一步的研究。