山慈菇對肝癌細胞凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響*

程清波，楊艷萍，王瀅，程文濤，張晉芬，張小莉

1.應(yīng)城市人民醫(yī)院，湖北 應(yīng)城 432400；2.武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)院，湖北 武漢 430000

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤疾病，在我國的死亡率高居惡性腫瘤第二位，而每年新發(fā)病例數(shù)量占全球50%以上，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為我國重大公共健康問題［1-2］。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)、放化療、靶點治療等手段不斷提高，肝癌得到一定程度的控制，但總體療效仍不理想［3］。近年來，中醫(yī)藥在腫瘤治療中的應(yīng)用受到越來越多的重視。中醫(yī)認為，腫瘤屬于“積聚”的范疇，《難經(jīng)》中記載：“肝之積為肥氣，在左脅下，如覆杯”［4］，其中肝積、肥氣等描述與肝癌相似。山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭和獨蒜蘭的假球莖，具有清熱解毒、消癰散結(jié)之功效［5-6］。研究顯示，山慈菇在乳腺癌、肝癌、胃癌等癌癥中表現(xiàn)出抗腫瘤作用，可明顯抑制新生毛細血管的生成［7-9］。現(xiàn)今山慈菇與肝癌的研究大多集中于杜鵑蘭的單體成分，而有關(guān)含藥血清的藥理研究較少?；诖耍狙芯靠疾焐酱裙胶幯澹≒seudobulbus Cremastrae seu Pleiones pharmaceutic serum，PCPS）對肝癌細胞HepG2生長運動、凋亡及間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，為山慈菇對肝癌的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗細胞與動物動物：40只健康SD大鼠，雌性，2月齡，體質(zhì)量180～220 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，許可證號：SYXK（京）2019-0030。大鼠正常攝食飲水，12 h/12 h晝夜交替，室內(nèi)溫度22～25℃，濕度40～60%。

細胞：人肝癌細胞HepG2（上海恒斐生物科技有限公司，貨號：SCC-110211）。

1.2 藥物與試劑山慈菇購自億弘堂藥業(yè)有限公司。Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（弗元生物科技有限公司，貨號：FY600016-20T）；二甲基亞砜（上海聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號：0231）；細胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit 8，CCK8）、EdU細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物，貨號：C0071S、C0038）；細胞固定液、甘氨酸（浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號：E703-1L、0167）；戊巴比妥鈉、滲透劑（化源網(wǎng)，貨號：57-33-0、1639-66-3）；上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、p27抗體、Survivin抗體、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）抗體和GAPDH抗體（圣克魯斯生物技術(shù)公司，貨號：sc-21791、sc-373717、sc-1641、sc-17779、sc-8424、sc-51332）；HRP標記的山羊抗兔二抗（武漢艾美捷科技有限公司，貨號：4030-05）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Worldrm生物商城，貨號：D6046）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（鄭州九龍生物制品有限公司，貨號：BC-B-021、JLAQ-110）；RIPA裂解液（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號：PC101）；蛋白定量試劑盒、結(jié)晶紫指示劑、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（上海源葉生物公司，貨號：R21252-500T、R22103、25535-16-4）；75%乙醇（南京化學(xué)試劑股份有限公司，貨號：64-17-5）。

1.3 儀器Transwell小室（北京明陽科華生物科技有限公司，貨號：BD-353502）；人工基底膜（北京盈豐大通科技有限公司，貨號：354234）；Being BPN-RHP型CO2培養(yǎng)箱（武漢集思儀器設(shè)備有限公司）；MA-6000型熒光定量PCR儀（濟南千司生物技術(shù)有限公司）；FrontierTM5000型離心機（美國奧豪斯公司）；BDF-25V270型低溫冰箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；BXF-80型倒置顯微鏡（上海炳宇光學(xué)儀器有限公司）；EPS-300型電泳儀（上海巴玖實業(yè)有限公司）；JS-680D型凝膠成像儀（杭州得聚儀器設(shè)備公司）；1703940型半干電轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司）；CytoFLEX型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；XSP-63B型熒光顯微鏡（上海光學(xué)儀器公司）；DNM-9606型酶標儀（南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司）；ZHBF-RE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京中環(huán)北方環(huán)?？萍加邢薰荆?。

2 方法

2.1 山慈菇濃煎液的制備準確稱取100 g山慈菇，將其粉碎后，置于去離子水中浸泡2 h，通過水煎法制備山慈菇提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至濃度為1 kg·L-1，即為山慈茹濃煎液［10］。

2.2 PCPS的制備將40只雌性SD大鼠隨機分為空白組和山慈菇低、中、高劑量組，每組10只，山慈菇低、中、高劑量組分別以5 mL·kg-1、10mL·kg-1、20mL·kg-1的劑量灌胃給予1 kg·L-1山慈菇濃煎劑，每天1次，連續(xù)6 d，空白組給予生理鹽水。末次給藥2 h后，以1 mL·kg-1的劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采血，靜置2 h，2 000 r·min-1離心15 min，離心半徑20 cm，分離上層血清，置于56℃水浴30 min，過濾除菌，置于-20℃?zhèn)溆茫?1］。

2.3 細胞培養(yǎng)肝癌細胞HepG2為貼壁細胞，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞，當細胞生長至80%時，進行消化傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細胞用于實驗檢測。

2.4 細胞形態(tài)觀察將HepG2細胞以1×106mL-1接種于6孔板，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養(yǎng)24 h，光鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化。

2.5 CCK8法檢測HepG2細胞活力將HepG2細胞以1×105mL-1接種于96孔板，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h及96 h后，加入含有10μL CCK8的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h（待培養(yǎng)基顏色變?yōu)槌壬?50 nm波長下檢測各孔吸光度。

2.6 EdU染色檢測HepG2細胞增殖將HepG2細胞以1×106mL-1接種于6孔板，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養(yǎng)24 h，再加入50μmol·L-1EdU培養(yǎng)基100μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，分別加入細胞固定液、甘氨酸、滲透劑進行細胞固化，Apollo染色和DNA染色后，于熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)粉色熒光細胞（即為增殖細胞）。

2.7 流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡將HepG2細胞以5×104mL-1接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養(yǎng)48 h，收集細胞，加入預(yù)冷的75%乙醇，4℃固定過夜，再分別加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育20 min，加入結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)上流式細胞儀進行檢測。

2.8 Transwell小室實驗檢測HepG2細胞侵襲以Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室底膜的上室面，置于六孔板，將HepG2細胞以1×106mL-1接種于Transwell小室上室，下室添加含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養(yǎng)24h，拭去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細胞，75%預(yù)冷酒精固定30 min后，以0.1%結(jié)晶紫染色5～10 min，光鏡下拍照并計數(shù)。

2.9 蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達將HepG2細胞以1×106mL-1接種于6孔板，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養(yǎng)24 h后，添加RIPA裂解液提取總蛋白，采用蛋白免疫印跡法檢測各組細胞中細胞周期抑制因子p27、凋亡抑制因子Survivin及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標記物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達，以GAPDH為內(nèi)參，計算各目的蛋白的相對表達量。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法采取統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0分析處理，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s）表示，本文所有實驗進行3次平行實驗，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PCPS對HepG2細胞形態(tài)的影響光鏡下觀察顯示，空白組細胞為橢圓形或短梭形，有短偽足；PCPS處理后細胞偽足減少，且20 mL·kg-1PCPS組細胞體積明顯增大。見圖1。

圖1 PCPS對HepG2細胞形態(tài)的影響（×200）

3.2 PCPS對HepG2細胞活力的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS處理后，細胞活力明顯降低（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS處理后細胞活力無明顯變化。見圖2。

圖2 PCPS對HepG2細胞活力的影響

3.3 PCPS對HepG2細胞增殖的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞增殖率明顯降低（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組細胞增殖率無明顯變化。見圖3。

3.4 PCPS對HepG2細胞凋亡的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組細胞凋亡率無明顯變化。見圖4。

圖4 PCPS對HepG2細胞凋亡的影響

3.5 PCPS對HepG2細胞侵襲的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞侵襲率明顯降低（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組細胞侵襲率無明顯變化。見圖5。

圖5 PCPS對HepG2細胞侵襲的影響

3.6 PCPS對HepG2細胞p27和Survivin蛋白表達的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞中p27蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），Survivin蛋白表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組細胞中p27和Survivin蛋白表達水平無明顯變化。見圖6。

圖6 PCPS對HepG2細胞p27和Survivin蛋白表達的影響

3.7 PCPS對HepG2細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞中E-cadherin蛋白的表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），而N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組上述蛋白表達水平無明顯變化。見圖7。

圖7 PCPS對HepG2細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達的影響

4 討論

由于對腫瘤的認識不足，多數(shù)肝癌患者確診時已進入中晚期，錯失治療的最佳時期，臨床治療時常加大化療劑量，控制肝癌細胞，但其毒副作用也非常明顯［12］。同時，長期化療可導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥，使治療效果不佳［13］。因此，尋求安全、有效的治療藥物，一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點。隨著各類腫瘤細胞和腫瘤動物模型研究的日益成熟，中藥以其療效肯定，藥性溫和，持續(xù)時間長的特點，在腫瘤康復(fù)治療中展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢［14-15］。龔正等［16］觀察不同中藥復(fù)方聯(lián)合鹽酸埃克替尼治療晚期非小細胞肺癌療效發(fā)現(xiàn)，艾愈膠囊（山慈菇、白英、當歸等）或復(fù)方斑蝥膠囊（斑蝥、人參、黃芪等）聯(lián)合鹽酸?？颂婺岬寞熜Ь鶅?yōu)于單用鹽酸埃克替尼，且不增加藥物的副作用。山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭和獨蒜蘭的假球莖，在臨床上多以復(fù)方入藥，用于腫瘤的治療?，F(xiàn)代藥理研究顯示，山慈菇提取的單體成分具有抗腫瘤作用，可通過細胞毒作用抑制腫瘤細胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移、抑制新生血管生成、誘導(dǎo)其凋亡及免疫調(diào)節(jié)等［17］。Liu等［18］從杜鵑蘭醇提物中分離的雙菲類化合物對乳腺癌細胞BT474和SKBR3有明顯的細胞毒性。姜爽等［19］觀察到山慈菇多糖對小鼠骨肉瘤細胞S180具有明顯的抑瘤作用，可能與提高機體免疫力有關(guān)。中藥藥理研究中，含藥血清藥理研究也是一種體外實驗法，可明顯克服粗體物體外實驗的干擾，更為接近中藥在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實過程［20］。陳思等［21］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，PCPS可有效抑制人乳腺癌細胞SK-BR-3的活性，加速細胞凋亡，并抑制其遷移能力。以上實驗充分肯定了山慈茹的抗腫瘤活性，但PCPS在肝癌中的抗腫瘤作用及其機制尚不完全清楚，因此，本研究通過體外實驗探究PCPS對肝癌細胞惡性生物學(xué)特征的影響及相關(guān)作用機制。

癌細胞生長、增殖、侵襲是腫瘤惡化的特征。本研究通過CCK8和EdU染色實驗發(fā)現(xiàn)，PCPS干預(yù)肝癌細胞后，可明顯抑制細胞的生長和增殖能力。p27蛋白是細胞周期負向調(diào)控因子的主要成員，主要對外部促進或抑制細胞增殖的信號起反應(yīng)［22］。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，經(jīng)PCPS處理后肝癌細胞中p27蛋白表達水平顯著上調(diào)，提示PCPS抑制肝癌HepG2細胞增殖可能與p27的激活有關(guān)。此外，在Transwell小室實驗中也發(fā)現(xiàn)，PCPS可顯著抑制肝癌細胞的侵襲能力。而癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithe-lialmesenchyml transition，EMT）密切相關(guān)［23］。Ecadherin為上皮標志蛋白，Vimentin和N-cadherin為間葉標志蛋白，它們在細胞黏附、遷移等方面發(fā)揮重要作用［24］，其中，Ecadherin下調(diào)、Vimentin和Fibronectin上調(diào)被認為是EMT發(fā)生的重要標志［25-26］。在本研究中，經(jīng)PCPS處理后，肝癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平顯著上調(diào)，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平顯著下調(diào)，提示PCPS可能通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制HepG2細胞的侵襲能力。

凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，能有序和有效地去除受損細胞，與很多疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，包括癌癥［27-28］。在本研究中，通過凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，PCPS處理HepG2細胞48 h后，細胞凋亡率明顯升高。Survivin蛋白作為重要的凋亡抑制因子，可直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶活性，阻斷細胞凋亡過程，還可與周期蛋白激酶相互作用阻滯凋亡信號通路［29］。蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PCPS處理后，HepG2細胞中Survivin蛋白表達水平明顯下調(diào)，提示PCPS可能通過下調(diào)Survivin蛋白的表達，從而誘導(dǎo)HepG2細胞的凋亡。此外，細胞偽足可促進細胞遷移、運動，偽足減少，貼壁生長的細胞會變圓脫落，從而促進細胞凋亡［30］。本研究通過光鏡下觀察各組細胞的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PCPS處理的HepG2細胞偽足減少，細胞明顯增大。細胞體積逐漸增大，會使細胞腫脹破裂，導(dǎo)致凋亡。以上結(jié)果再次提示，PCPS可以促進肝癌細胞的凋亡。另外，本研究實驗中以10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組效果更為顯著，提示山慈菇的臨床應(yīng)用中需要注意其劑量，以保證其更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，PCPS可有效抑制HepG2細胞的增殖、侵襲能力，誘導(dǎo)凋亡，抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。