基于雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌

◎ 王一萍，段林潔，曾杰生，劉華敏，王 哲

（廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院），廣東 佛山 528000）

食品安全關(guān)系民生大計(jì)，食源性致病菌是引發(fā)食品安全問題的主要因素[1-2]，其中副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌最為常見[3-4]。副溶血性弧菌是一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌，常存在于海蝦、魚、牡蠣等海產(chǎn)品中[5-6]，食用攜帶該菌的食物常會(huì)引起急性腸胃炎等食物中毒現(xiàn)象。沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌，在全球食物中毒病例中的分離率最高，常存在于蛋類、肉類中[7-8]。感染沙門氏菌后會(huì)引起腸道炎，在極端情況下可能引發(fā)系統(tǒng)感染[9]。目前，常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)主要有顯色培養(yǎng)基技術(shù)[10]、熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)、膠體金技術(shù)[11]、免疫層析試紙條[12]和Southem Blot雜交技術(shù)等[13-15]，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)[16]，但均不能有效實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。數(shù)字PCR技術(shù)[17]作為新一代的PCR技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)單分子絕對(duì)定量[18-19]，其通過對(duì)樣本的有限稀釋，將待測(cè)樣本均勻分配到微反應(yīng)單元中，擴(kuò)增后讀取每個(gè)微反應(yīng)單元的終末熒光信號(hào)，結(jié)合泊松分布統(tǒng)計(jì)原理，能夠?qū)ζ鹗寄０宸肿咏^對(duì)定量，目前廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)[20-21]、癌癥診斷和治療、食品成分分析[22-23]和食源性致病菌的檢測(cè)[24-27]等方面。一種有效可靠的檢測(cè)方法對(duì)保障食品安全和人們健康起著至關(guān)重要的作用，本文首次采用非特異性核酸染料Eva Green建立雙重ddPCR（數(shù)字PCR）體系，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)食品中的副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌，提高檢測(cè)方法的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣，市購；副溶血弧菌，ATCC 17802；鼠傷寒沙門氏菌，ATCC 14028；大腸埃希氏菌，ATCC 25922；阪崎腸桿菌，ATCC 29544；福氏志賀氏菌，ATCC 12022；金黃色葡萄球菌，ATCC 25923；單核增生李斯特氏菌，ATCC 19115；蠟樣芽孢桿菌，CMCC（B）63303；糞腸球菌，ATCC 29212；DNA提取試劑盒，南京諾唯贊生物科技公司；Eva Green熒光染料，美國(guó)Biotium；數(shù)字PCR擴(kuò)增試劑盒，佛山丁智生物科技。

1.2 儀器與設(shè)備

QX200微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)儀，美國(guó)伯樂公司；數(shù)字PCR微滴生成儀，廣州永諾生物科技；A300快速梯度PCR擴(kuò)增儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；1-16K高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)西格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司；Nano Drop 2000微量分光光度計(jì)，美國(guó)賽默飛科技。

1.3 研究方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

本研究以副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因（tlh）和鼠傷寒沙門氏菌侵襲蛋白A基因（invA）作為靶標(biāo)基因，從GeneBank數(shù)據(jù)庫已知基因序列中選取特異性片段設(shè)計(jì)引物，并由上海賽默飛科技公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.3.2 DNA提取

將副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)8 h，副溶血弧菌、鼠傷寒沙門氏菌各取500 μL菌液（108CFU·mL-1），根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取DNA，提取后的DNA以超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000測(cè)定其濃度及純度，并于-20 ℃下保存。使用前將副溶血弧菌、鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋。

1.3.3 引物和染料濃度優(yōu)化

對(duì)染料添加量、tlh和invA引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，使各熒光條帶達(dá)到最佳區(qū)分度，減少不確定微滴數(shù)。雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火延伸1 min，50個(gè)循環(huán)，98 ℃固化熒光10 min，最后用檢測(cè)儀進(jìn)行微滴分析。

1.3.4 特異性試驗(yàn)

按1.3.2中所述提取材料，對(duì)1.1中9種菌株的DNA提取稀釋，取稀釋倍數(shù)為104的DNA濃度為模板，按照優(yōu)化后的體系進(jìn)行數(shù)字PCR，檢測(cè)該雙重?cái)?shù)字PCR體系的特異性。

1.3.5 靈敏度試驗(yàn)

取10倍梯度稀釋的副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)，確定該雙重?cái)?shù)字PCR的檢測(cè)范圍；將副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌DNA混合后進(jìn)行雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3次。確定雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)方法的靈敏度，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行線性分析，文中所有線形圖均通過Excel分析制作。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立好的雙重?cái)?shù)字PCR方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，以稀釋倍數(shù)為103、104、105、106的副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌DNA作為模板，每個(gè)濃度做3次重復(fù)檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判斷該方法的重復(fù)性。

1.3.7 人工污染樣品檢測(cè)

將新鮮的牡蠣肉在流動(dòng)的水下沖洗10 min，無菌條件下稱取25 g牡蠣肉，加入225 mL的無菌水混合研磨制成勻漿液，取9 mL勻漿液分別加入1 mL不同濃度的副溶血弧菌菌液和鼠傷寒沙門氏菌菌液，混合后各取500 μL，分別提取基因組DNA作為模板，進(jìn)行雙重?cái)?shù)字PCR試驗(yàn)，確定其最低檢測(cè)限。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和染料濃度優(yōu)化

為探究適宜的tlh和invA引物濃度及Eva Green添加量，設(shè)置8組不同濃度組合，見表2?？紤]成本和最佳區(qū)分度，最終選擇tlh引物濃度為80 nmol·L-1，invA引物濃度為40 nmol·L-1，引物添加量為2.7 μL，在此濃度下各熒光條帶的區(qū)分度達(dá)到最佳，見圖1。由圖1可知，invA的單陽性微滴熒光強(qiáng)度約為28 000，tlh單陽性微滴的熒光強(qiáng)度約為34 000，同時(shí)包含tlh和invA的微滴熒光強(qiáng)度約為41 000，手動(dòng)設(shè)置閾值可對(duì)每個(gè)分區(qū)的微滴數(shù)進(jìn)行分析，從而得到兩種不同模板的拷貝數(shù)。

表2 tlh和invA不同引物濃度組合表

圖1 最優(yōu)引物濃度、染料添加量下數(shù)字PCR微滴分布及其直方圖

2.2 特異性試驗(yàn)

數(shù)字PCR體系僅擴(kuò)增含有副溶血性弧菌和沙門氏菌的模板，對(duì)其他7種菌株均無陽性微滴，表明建立的雙重?cái)?shù)字PCR體系特異性強(qiáng)，可專用于檢測(cè)副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌，特異性檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2 特異性檢測(cè)結(jié)果圖

2.3 靈敏度試驗(yàn)

為檢測(cè)該體系靈敏度，將模板梯度稀釋進(jìn)行雙重?cái)?shù)字PCR試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。每個(gè)孔生成的微滴數(shù)量＞13 000個(gè)，表明該結(jié)果具有可靠性。tlh和invA的拷貝數(shù)通過Quantasoft軟件設(shè)置閾值分析得到。當(dāng)DNA稀釋倍數(shù)為102，即DNA濃度為1 ng·μL-1時(shí)，所有微滴均為雙陽性微滴。該方法可檢測(cè)出DNA稀釋倍數(shù)為107的模板，對(duì)副溶血弧菌tlh的最低檢測(cè)線為16.8 copies/20 μL，見表3，invA的最低檢測(cè)限為8.6 copies/20 μL，說明該方法對(duì)于檢測(cè)副溶血弧菌和沙門氏菌具有較高的靈敏度。在DNA濃度為1.0×105～ 10.0 fg·μL-1時(shí)，數(shù)字 PCR 拷貝數(shù)與 DNA稀釋倍數(shù)之間具有較好的線性關(guān)系，如圖4所示，tlh和invA的R2均＞0.99。

圖4 數(shù)字PCR拷貝數(shù)與DNA稀釋倍數(shù)的線性關(guān)系圖

表3 數(shù)字PCR靈敏度分析表

圖3 不同濃度梯度下數(shù)字PCR微滴分布圖

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

以106、105、104、103稀釋倍數(shù)的副溶血弧菌和沙門氏菌DNA作為模板，每個(gè)濃度做3次重復(fù)檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析該方法的重復(fù)性。副溶血弧菌tlh在不同模板濃度下的變異系數(shù)分別為4.69%、3.35%、2.67%、3.69%，見表4。鼠傷寒沙門氏菌invA的變異系數(shù)分別為3.06%、2.34%、4.87%、3.53%，見表5，所有變異系數(shù)均小于5%，說明該方法檢測(cè)副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌重復(fù)性較好。

表4 不同濃度tlh數(shù)字PCR重復(fù)性試驗(yàn)表

表5 不同濃度invA數(shù)字PCR重復(fù)性試驗(yàn)表

2.5 人工污染樣本檢測(cè)

通過本文建立的數(shù)字PCR方法，檢測(cè)不同菌量人工污染的新鮮牡蠣樣本中的副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)菌濃度為106CFU·mL-1時(shí)，只有1個(gè)陰性微滴，超出檢測(cè)范圍。對(duì)人工染菌樣本，最低可檢測(cè)出的菌濃度為10 CFU·mL-1，tlh最低檢出限為18.6 copies/20 μL，invA的最低檢出限是9.8 copies/20 μL。在人工污染樣本的檢測(cè)中，菌濃度和數(shù)字PCR拷貝數(shù)呈現(xiàn)較好線性關(guān)系（R2均＞0.98），如圖6所示。

圖5 用不同濃度菌人工污染牡蠣樣本的微滴熒光分布圖

圖6 數(shù)字PCR拷貝數(shù)與菌濃度線性關(guān)系圖

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)食品檢測(cè)的日益重視，對(duì)食源性致病菌檢測(cè)方法的建立和研究變得越來越重要。目前用于食源性致病菌檢測(cè)的方法主要是傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)和PCR技術(shù)，傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、分辨率低、容易出現(xiàn)假陽性[28]，熒光定量PCR依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，抑制劑對(duì)其擴(kuò)增影響明顯[29]。和熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，抑制劑對(duì)其影響小，檢測(cè)靈敏度高[30-31]。數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)限低，穩(wěn)定性高在食品安全應(yīng)用中具有巨大的潛力[32-33]，且數(shù)字PCR技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。

近年來，隨著數(shù)字PCR的發(fā)展，其應(yīng)用越來越廣泛，尤其在食品安全方面，常用于食源性致病菌的檢測(cè)，如周巍等人[34]利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)乳制品中的金黃色葡萄球菌，檢測(cè)特異性良好，檢測(cè)靈敏度為3.3×101CFU·g-1；趙麗青等人[35]通過數(shù)字PCR檢測(cè)食品中的單增李斯特菌，檢出限為（3.6±0.1）copies/20 μL；WANG等人[36]利用數(shù)字PCR檢測(cè)牛奶中的鼠傷寒沙門氏菌，結(jié)果表明，與熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR靈敏度高且抑制劑影響小。

目前，用單一染料同時(shí)檢測(cè)兩種食源性致病菌的研究較少。本文建立的數(shù)字PCR方法可實(shí)現(xiàn)使用一種染料同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌兩種菌，其特異性強(qiáng)、靈敏度高，可檢測(cè)出107稀釋倍數(shù)的DNA模板，在檢測(cè)副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌時(shí)變異系數(shù)均小于5%，對(duì)于兩種菌的檢測(cè)菌具有很好的重復(fù)性。在人工污染樣本中可檢測(cè)出10 CFU·mL-1的樣本。本文提供的數(shù)字PCR方法可快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌，對(duì)食品安全具有重要意義。