大鼠心肌梗死后迷走神經(jīng)重構(gòu)及毛果蕓香堿的心臟保護(hù)作用

孫責(zé) 于海波 薛晴 于海濤 賈琳琳 王芳芳 關(guān)政 李晶，4

(佳木斯大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007；2研究生院； 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4黑龍江省微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

心血管疾病發(fā)病率在不斷增加〔1～4〕，致殘率和致死率在全球范圍呈現(xiàn)高趨勢(shì)發(fā)展的就是急性心肌梗死(AMI)〔5〕。要降低這些概率就要及時(shí)發(fā)現(xiàn)、正確診斷和治療〔6〕。由于冠狀動(dòng)脈缺血缺氧后會(huì)有心肌壞死(臨床表現(xiàn)為典型的胸骨后疼痛)而誘發(fā)心力衰竭，進(jìn)而危及生命〔7〕，最終造成機(jī)體死亡〔8，9〕。由于AMI是心血管疾病患者死亡的主要原因〔10〕，目前常規(guī)傳統(tǒng)的治療方法已取得一定成效，如溶栓、藥物、介入手術(shù)、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等。但對(duì)一些特殊病變(如彌漫性、復(fù)發(fā)性、多支病變)傳統(tǒng)治療方法效果并不好〔11，12〕，造成患者生活質(zhì)量明顯下降〔13〕。而自主神經(jīng)異常，尤其是迷走神經(jīng)重構(gòu)與心肌梗死后患者猝死關(guān)系緊密，由于迷走神經(jīng)節(jié)后纖維釋放遞質(zhì)乙酰膽堿作用于心肌細(xì)胞的M受體而發(fā)揮作用；研究發(fā)現(xiàn)對(duì)很多心血管病起到保護(hù)作用的是M3受體，作為M3受體激動(dòng)劑的毛果蕓香堿(pilcocarpine)目前主要用于臨床眼科治療(青光眼)、口干燥癥、阿托品中毒等〔14〕，其對(duì)心臟的保護(hù)作用和內(nèi)臟痛的治療研究甚少。因此，本研究探討大鼠心肌梗死后迷走神經(jīng)重構(gòu)及毛果蕓香堿的心臟保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性SPF級(jí)SD大鼠(體重約220 g)，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證書：SYXK(黑)2018-001，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)佳木斯大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R 原則施行人道主義關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器 鹽酸毛果蕓香堿(上海阿拉丁生活科技股份有限公司)；戊巴比妥鈉(天津施維雅制藥有限公司)；注射用青霉素(哈藥集團(tuán)制藥總廠)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒96T(南京建成生物公司)；PL-200 熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司);2390型電子機(jī)械性痛敏儀(美國(guó)IITC公司)；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及HX-300S小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；各類哺乳動(dòng)物手術(shù)器械：手術(shù)剪、眼科剪、鑷子、止血鉗、持針器、手術(shù)線、注射器、眼科開(kāi)瞼器、擴(kuò)胸器等。

1.3動(dòng)物分組與模型建立 大鼠在做手術(shù)前均需要禁食、禁水12 h。梗死組模型建立方法：用30 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后背位固定在手術(shù)臺(tái)上，借助小兒喉鏡經(jīng)口進(jìn)行氣管插管，并連好小動(dòng)物呼吸機(jī)(呼吸比調(diào)成1∶1，潮氣量調(diào)成15 ml)，同步記錄心電圖(ECG)改變(BL-420F 生物信號(hào)采集放大系統(tǒng))。在左側(cè)第4、5肋間隙消毒后開(kāi)胸，剪破心包膜以便暴露心臟，用7號(hào)無(wú)菌手術(shù)線結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈(不可過(guò)深或過(guò)淺，約厚0.5 mm、寬2.0 mm)，若結(jié)扎成功肉眼可見(jiàn)心尖部位缺血后顏色變白、搏動(dòng)減弱，同時(shí)能看到ECG中ST段顯著高抬〔15〕。假手術(shù)組術(shù)前準(zhǔn)備和梗死組一樣，區(qū)別在于開(kāi)胸后看到左冠狀動(dòng)脈前降支后不需要結(jié)扎，只是把手術(shù)線從其下方穿過(guò)即可。毛果蕓香堿組術(shù)前操作步驟及手術(shù)方法和梗死組一樣，不同在于模型建立成功后需要舌下靜脈注射毛果蕓香堿，按 0.2 mg/kg持續(xù)給藥28 d。

1.4描計(jì)ECG方法 運(yùn)用BL-420F 生物信號(hào)采集放大系統(tǒng)描計(jì)，把大鼠用戊巴比妥鈉麻醉成功后，以仰臥位方式固定在大鼠手術(shù)臺(tái)上，將1 ml注射器針頭分別插入大鼠的兩前肢和右后肢皮下，并且連接不同顏色電極后借助實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)輸出相應(yīng)的電信號(hào)即ECG改變(標(biāo)Ⅱ?qū)?lián))，具體電極連接方法是右前肢連白色，右后肢連黑色，左后肢連紅色。

1.5檢測(cè)血清LDH、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)變化 血清LDH、FABP含量的檢測(cè)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。具體操作步驟如下：做完實(shí)驗(yàn)后各組大鼠取血，離心機(jī)離心(3 000 r/min離心10 min)后取上清液備用。按說(shuō)明書要求，首先加上待檢測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品與平行樣本稀釋，以加入辣根過(guò)氧化物酶一抗作為標(biāo)志，37℃ 60 min孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板5次，37℃避光條件下孵育15 min后加入二抗，后加入顯色液及終止液，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。

1.6梗死面積測(cè)定 取大鼠心臟分離出心室，以左心室為例，切割2 mm每份的組織(從心尖一直到心底)，在37℃溫度下用氯化三苯基四氮唑溶液中孵育10 min，在多聚甲醛中固定24 h。視覺(jué)觀察到梗死部分心肌組織變白，而非梗死部分是紅色的。梗死面積大小測(cè)定借助BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，具體計(jì)算公式為每片切片梗死心肌之和/整個(gè)左心室面積×100%。

1.7迷走神經(jīng)支配密度、M3受體mRNA 迷走神經(jīng)支配密度(μm2/mm2)的測(cè)定用Motic Images3000計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)，等于神經(jīng)纖維面積/總檢測(cè)面積。即免疫組化定量分析，組化按常規(guī)操作：固定在甲醛溶液中后脫水、浸蠟、包埋后切片，30 min預(yù)熱，15 min抗原修復(fù)后冷卻1 h，加一抗后加酶標(biāo)二抗，中間用PBS沖洗，最后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，陽(yáng)性為棕色顆粒。M3受體mRNA檢測(cè)：用試劑盒提取總 RNA，質(zhì)量分析用凝膠電泳，純度和含量測(cè)定用紫外分光光度計(jì)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)處理總RNA，其反應(yīng)產(chǎn)物用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，密度掃描及UV 照相是把PCR產(chǎn)物借助瓊脂糖凝膠后電泳的結(jié)果，mRNA相對(duì)表達(dá)量以M3受體和內(nèi)參電泳條帶的灰度值計(jì)算。

1.8機(jī)械痛閾與熱痛閾的測(cè)定 安靜室內(nèi)，適宜溫度和濕度，借助PL-200 熱刺痛儀檢測(cè)，計(jì)算由于輻射熱源刺激大鼠造成縮足反射所需要的時(shí)間，即熱痛閾。機(jī)械痛閾的測(cè)定是用美國(guó) IITC 公司生產(chǎn)的 2390 型電子機(jī)械性痛敏儀進(jìn)行，主要計(jì)算兩后爪的縮足閾值，具體操作為：把大鼠放在透明的有機(jī)玻璃盒子中，盒子底部是框架結(jié)構(gòu)，可放入刺激探針。先讓大鼠適應(yīng)這個(gè)環(huán)境，把直徑 0.5 mm探針緩慢垂直抬高，直至碰到大鼠后腳掌中心，刺激強(qiáng)度逐漸加大，直到大鼠腳趾縮回去記錄當(dāng)時(shí)的壓力值。基礎(chǔ)痛閾的測(cè)定在術(shù)前1 d進(jìn)行。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.13組ECG改變情況 與術(shù)前比較，梗死組ECG出現(xiàn)明顯抬高的ST段；毛果蕓香堿組抬高的ST段較梗死組顯著下降；假手術(shù)組未出現(xiàn)明顯ST段。

2.23組梗死面積百分率 梗死組心肌梗死面積為(48.93±5.02)%，毛果蕓香堿組為(25.67±4.15)%，假手術(shù)組為(0.00±0.00)%，3組梗死面積百分率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.33組血清LDH、FABP變化 與假手術(shù)組比較，梗死組與毛果蕓香組血清LDH、FABP水平顯著升高(P<0.05)；與梗死組比較，毛果蕓香堿組血清LDH、FABP顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.43組迷走神經(jīng)支配密度、M3受體mRNA變化 與假手術(shù)組比較，梗死組迷走神經(jīng)支配密度、M3受體mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加；與梗死組比較，毛果蕓香堿組二者表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.53組機(jī)械痛閾、熱痛閾的改變 治療前，3組基礎(chǔ)痛域無(wú)明顯差異(P>0.05)；治療后，毛果蕓香堿組內(nèi)臟疼痛明顯緩解；與梗死組比較，毛果蕓香堿組機(jī)械痛閾顯著增加，熱痛閾顯著降低(均P<0.05)，見(jiàn)表2、表3。

表1 3組外周血血清中LDH、FABP含量及迷走神經(jīng)支配密度、M3受體mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表2 3組機(jī)械痛閾改變

表3 3組熱痛閾改變

3 討 論

起病危重的AMI最容易出現(xiàn)并發(fā)癥，致死率很高〔16，17〕。其發(fā)生在于不同誘因造成冠狀動(dòng)脈血流不夠，出現(xiàn)壞死、水腫、充血，同時(shí)伴隨炎細(xì)胞的出現(xiàn)，導(dǎo)致心肌纖維化，大大降低心功能，表現(xiàn)為心力衰竭。而心力衰竭的出現(xiàn)可能與炎細(xì)胞過(guò)度激活進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、壞死有關(guān)〔18,19〕。通常情況下，重構(gòu)或壞死、水腫的心肌一般不能全部恢復(fù)正常，因?yàn)樾募≡偕芰τ邢蕖Ａ硗?，一旦心肌出現(xiàn)壞死，還可能出現(xiàn)在壞死部分或壞死周圍有一小部分還存活的心肌細(xì)胞，這也是AMI出現(xiàn)心律失常的原因。同時(shí)，AMI后會(huì)伴隨心前區(qū)的內(nèi)臟疼痛。因此，AMI研究關(guān)鍵是藥物治療改善癥狀的同時(shí)還要具有減輕內(nèi)臟疼痛的效果。

AMI發(fā)生時(shí)，由于壞死和缺血的影響可造成迷走神經(jīng)的損傷和再生的過(guò)程，而自主神經(jīng)的異常又是造成猝死和心律失常的主要誘因。本研究證明毛果蕓香堿具有減輕迷走神經(jīng)重構(gòu)，加強(qiáng)再生的神經(jīng)正?；?，進(jìn)而減低并發(fā)癥和猝死的出現(xiàn)。M3受體可與乙酰膽堿(Ach)遞質(zhì)結(jié)合，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的生理特性(興奮、傳導(dǎo)、收縮性)，同時(shí)能介導(dǎo)鉀離子通道。本研究提示在病理狀態(tài)下心肌 M3受體表達(dá)會(huì)增加，也可能和心肌缺血壞死后鉀電流密度增加有關(guān)；經(jīng)毛果蕓香堿M3受體激動(dòng)劑治療后降低，證實(shí)毛果蕓香堿能夠減弱M3受體mRNA相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的生理特性來(lái)降低AMI并發(fā)癥的出現(xiàn)。

生化指標(biāo)檢測(cè)在AMI中作用也很大，LDH能判斷心肌是否損傷；心臟型脂肪酸立即釋放，臨床上對(duì)肺栓塞、腦卒中的診斷及預(yù)后價(jià)值較大〔20，21〕。它是判定缺血具有高靈敏度的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)：毛果蕓香堿組與梗死組比：血清LDH、FABP下降，可能原因是作為脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子的FABP可造成脂質(zhì)代謝紊亂，生成氧自由基，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞正常的心功能引起AMI〔22～24〕。通常情況下，各種社會(huì)、心理、身體等諸多因素都會(huì)影響痛閾的變化〔25〕，而這些變化的發(fā)生都和痛覺(jué)的內(nèi)源性調(diào)控相關(guān)，在這個(gè)系統(tǒng)中存在抑制系統(tǒng)和易化系統(tǒng)，且二者始終處在一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，因而在一定范圍內(nèi)，生物個(gè)體都具有穩(wěn)定的痛閾。目前，臨床鎮(zhèn)痛手段有超前鎮(zhèn)痛，即把自身內(nèi)源性鎮(zhèn)痛機(jī)制及時(shí)啟動(dòng)來(lái)達(dá)到止痛效果。本研究顯示AMI大鼠內(nèi)臟痛的變化，說(shuō)明毛果蕓香堿能夠啟動(dòng)并激活內(nèi)源性調(diào)控系統(tǒng)中的抑制機(jī)制來(lái)降低痛感，減輕痛苦。

綜上，毛果蕓香堿可借助LDH、FABP水平的下降來(lái)削弱心肌損傷和缺血；通過(guò)減弱M3受體mRNA相對(duì)表達(dá)量、減輕迷走神經(jīng)重構(gòu)來(lái)降低AMI并發(fā)癥的出現(xiàn)；通過(guò)調(diào)節(jié)痛閾來(lái)降低疼痛感。因此，毛果蕓香堿具有心肌保護(hù)和緩解疼痛的作用，為AMI治療及疼痛緩解提供了科研依據(jù)。