香瓜根結(jié)線蟲種類鑒定及殺線劑的室內(nèi)毒力測(cè)定

李周容，孫燕芳，陳 園，裴月令，馮推紫，龍海波

（1. 海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，?？冢?70228; 2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？冢?71101）

西甜瓜（西瓜、哈密瓜、香瓜等）是海南熱帶特色高效農(nóng)業(yè)的“王牌”產(chǎn)業(yè)，2020年海南種植面積近333 333.33 hm?2，年產(chǎn)值約100億元[1]。其中，冬春季種植的薄皮甜瓜年均播種面積3 000～4 000 hm?2，因栽培周期短、上市早、經(jīng)濟(jì)效益好，已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的主要產(chǎn)業(yè)之一[2]。近年來，隨著種植年限的增加和重茬連作，由根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）引起的根結(jié)線蟲病已成為海南西甜瓜生產(chǎn)上的一種主要根部病害，尤其在樂東、東方、三亞的設(shè)施大棚甜瓜種植上普遍發(fā)生，一般可導(dǎo)致20%～30%產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失在50%以上甚至絕收[3?4]。由于缺乏有效的抗病品種，生產(chǎn)上主要依賴化學(xué)殺線劑防治西甜瓜根結(jié)線蟲病害。目前，市場(chǎng)上應(yīng)用較普遍的有阿維菌素、噻唑膦和氟吡菌酰胺等少數(shù)非熏蒸性類殺線劑。西甜瓜根結(jié)線蟲病病原發(fā)生種類較多，孔祥義等[5]報(bào)道大棚甜瓜根結(jié)線蟲病病原有南方根結(jié)線蟲（M. incognita）、花生根結(jié)線蟲（M. arenaria）和北方根結(jié)線蟲（M. hapla）。龍海波等[6]鑒定危害海南哈密瓜上的甜瓜根結(jié)線蟲病病原的主要種類有南方根結(jié)線蟲（M. incognita）、爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）和象耳豆根結(jié)線蟲（M. enterolobii）；張國(guó)鋒等[7]報(bào)道了南方根結(jié)線蟲（M. incognita）是危害西瓜根結(jié)線蟲的優(yōu)勢(shì)種群。在對(duì)海南西甜瓜線蟲病害的調(diào)查過程中，筆者發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲侵染危害露地栽培香瓜（Cucumis meloL. var. makuwa cv. ‘Silver Light’）。本研究采用形態(tài)和分子鑒定對(duì)采集的根結(jié)線蟲進(jìn)行種類鑒定，同時(shí)篩選了幾種常用的殺線劑品種，分析測(cè)定其對(duì)采集的海南香瓜根結(jié)線蟲種群的毒力，旨在為高效防控田間根結(jié)線蟲病害提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試病樣于2019年在海南省文昌市烏雞塘村采集到具有明顯“根結(jié)”癥狀的香瓜病根。從香瓜病根挑取飽滿的單卵囊接種至長(zhǎng)豐3號(hào)辣椒上進(jìn)行保種、繁殖及純化培養(yǎng)。

1.2 供試藥劑及配制濃度將供試原藥用丙酮配制成母液，再用0.1%的吐溫80水溶液配制成5個(gè)濃度（表1）。

表1 藥劑及其濃度Tab. 1 Nematicides and their concentrations

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 根結(jié)線蟲形態(tài)鑒定直接挑取香瓜根系上的卵囊孵化得到2齡幼蟲，用挑針從病根組織中分離獲得雌蟲。參照劉維志[8]所描述的方法進(jìn)行觀察，測(cè)量并記錄2齡幼蟲體長(zhǎng)，最大體寬，口針長(zhǎng)度，尾長(zhǎng)等形態(tài)指標(biāo)。2齡幼蟲的觀察樣本數(shù)為20頭。參照張紹升[9]所描述的方法制作雌蟲會(huì)陰花紋永久玻片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 根結(jié)線蟲DNA提取根據(jù)1.3方法得到2齡幼蟲懸浮液，參照龍海波等[6]的方法，挑取單頭2齡幼蟲進(jìn)行DNA提取并于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 rDNA-ITS序列擴(kuò)增利用萬新龍等[10]設(shè)計(jì)的引物V5367 (TTGATTACGTCCCTGCCCTTT)和26s (TTTCACTCGCCGTTACTAAGG) 擴(kuò)增根結(jié)線蟲ITS序列。PCR反應(yīng)使用ExTaq酶PCR擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa），擴(kuò)增體系參照龍海波等[6]的方法。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)觀察，并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，最后挑取陽(yáng)性克隆送至廣州華大基因科技有限公司測(cè)序，將獲得的線蟲rDNA-ITS區(qū)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中根結(jié)線蟲序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.4 線蟲SCAR標(biāo)記特異性引物檢測(cè)利用LONG等[11]設(shè)計(jì)的象耳豆根結(jié)線蟲SCAR標(biāo)記的特異引物MeF (AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG) 和MeR (TCAGTTCAGGCAGGATCAACC) 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物電泳檢測(cè)方法同1.5。

1.3.5 藥劑毒力的測(cè)定采用浸漬法，將1.3方法中得到的2齡幼蟲懸浮液調(diào)制為400條·mL?1備用。取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1 mL配制好的各濃度藥劑，分別加入1 mL根結(jié)線蟲2齡幼蟲懸浮液，以0.1%的吐溫80水溶液做空白對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)4次。將藥劑處理的2齡幼蟲懸浮液于28 ℃培養(yǎng)箱中放置24 h后，將每處理中的加藥線蟲懸浮液轉(zhuǎn)移至生物計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下觀察，活的線蟲蟲體呈現(xiàn)有弧度的彎曲，而死亡的線蟲身體僵直（圖1），10 min內(nèi)完成統(tǒng)計(jì)。

圖1 顯微鏡下活的及死亡的象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲Fig. 1 The live and dead second instar larvae of M.enterolobii under microscope

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用Excel、SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)算各處理的死亡率和校正死亡率，并用機(jī)率值分析法計(jì)算出各個(gè)藥劑的致死中濃度LC50值和95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征2齡幼蟲和雌蟲會(huì)陰花紋的顯微觀察：2齡幼蟲呈線形，體環(huán)小、頭冠明顯、側(cè)唇大呈三角形；口針纖細(xì)，基部球大且圓，與口針基桿分界明顯；中食道球呈橢圓形，直腸膨大；透明尾區(qū)界限明顯，尾尖鈍圓（圖2-a，b）。具體測(cè)量值為（n=20）：體長(zhǎng)（L）為383～475 μm，體寬（W）為14.3～17.7 μm，口針長(zhǎng)（ST）為11.8～13.5 μm，背食道腺開口到口針基球附近的距離（DGO）為3.2～5.8 μm，尾長(zhǎng)（Tail）為46.2～61.5 μm。雌蟲會(huì)陰花紋呈橢圓形，背弓較高，線紋緊密且細(xì)，呈波浪形（圖2-c），且大多數(shù)會(huì)陰花紋無側(cè)線，少數(shù)具1條或2條不明顯的側(cè)線。

圖2 香瓜根結(jié)線蟲形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of the muskmelon rootknot nematode

2.2 分子鑒定利用根結(jié)線蟲通用引物V5367和26s，對(duì)該種群的rDNA-ITS區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增，均獲得了大小約750 bp的電泳條帶（圖3-a），B1astN同源性搜索比對(duì)顯示，該種群與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的象耳豆根結(jié)線蟲（M. enterolobii）一致性為99.9%。利用象耳豆根結(jié)線蟲特異性引物MeF/MeR擴(kuò)增該種群的ITS2序列，均獲得長(zhǎng)度約300 bp的特異條帶，空白對(duì)照無擴(kuò)增條帶（圖3-b）。

圖3 香瓜根結(jié)線蟲rDNA-ITS (a) 及ITS2 (b) 序列擴(kuò)增Fig. 3 Amplification of rDNA-ITS (a) and ITS2 (b) sequence of the muskmelon root-knot nematode

2.3 3種殺線劑對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲的毒力由表2可知，供試藥劑處理24 h后，3種殺線劑對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲的毒力大小順序?yàn)榘⒕S菌素>噻唑膦>氟吡菌酰胺，LC50值分別為0.351、0.820和7.783 mg·L?1。

表2 3種殺線蟲劑對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲的室內(nèi)毒力Tab. 2 The toxicity of 3 nematicides to M. enterolobii in laboratory

3 討 論

經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，本實(shí)驗(yàn)采集的香瓜根結(jié)線蟲種類確定為象耳豆根結(jié)線蟲（M.enterolobii），這是國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲侵染危害香瓜。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道象耳豆根結(jié)線蟲可以侵染包括豆科、茄科、葫蘆科中的多種蔬菜，以及玉米、棉花、煙草等重要糧食和經(jīng)濟(jì)作物[12?15]。研究發(fā)現(xiàn)，象耳豆根結(jié)線蟲比南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲等常見種類具有更強(qiáng)的致病力，能夠克服N、Mi-1、Mh、Rk等多個(gè)抗病基因，被認(rèn)為是最具危害性的植物病原根結(jié)線蟲之一[16]。值得高度警惕的是，近年來象耳豆根結(jié)線蟲在海南全省快速擴(kuò)散蔓延，已取代南方根結(jié)線蟲成為冬季瓜菜上的優(yōu)勢(shì)種類，對(duì)瓜菜產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)安全構(gòu)成了嚴(yán)重現(xiàn)實(shí)威脅。

選用高效低毒化學(xué)殺線劑是現(xiàn)階段防治根結(jié)線蟲病害的主要手段。本研究選用幾種主流的殺線劑原藥進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，阿維菌素對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲幼蟲具有最高的殺蟲活性（LC50=0.351 mg·L?1），噻唑膦（LC50=0.82 mg·L?1）和氟吡菌酰胺對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲幼蟲的殺蟲活性（LC50）分別為0.82 mg·L?1和7.783 mg·L?1。FASKE等[17]和YUE等[18]測(cè)定阿維菌素對(duì)南方根結(jié)線蟲幼蟲的LC50值分別為0.42 mg·L?1和0.68 mg·L?1，與本研究測(cè)定的對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲的毒力大小相近，表明阿維菌素是一種較穩(wěn)定且高效的藥劑。另外，YUE等[18]測(cè)定氟吡菌酰胺對(duì)南方根結(jié)線蟲LC50值為0.13 mg·L?1，與本研究測(cè)定的對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲的毒力差異較大，原因很可能是由于采集的香瓜象耳豆根結(jié)線蟲種群對(duì)氟吡菌酰胺已產(chǎn)生了一定的抗藥性。本研究測(cè)定的不同類型殺線劑的室內(nèi)毒力結(jié)果是指導(dǎo)田間用藥的一個(gè)理論依據(jù)，但由于實(shí)際防治效果還受到劑型、助劑、線蟲抗藥性水平等多種因素的影響，下一步還需對(duì)含有阿維菌素、噻唑膦和氟吡菌酰胺等有效成分的商品制劑進(jìn)行田間測(cè)試驗(yàn)證。