應用分子標記輔助選育低谷蛋白水稻新品種

田孟祥 何友勛 趙 龍 張時龍 余本勛 葉永印

（畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學研究所 貴州畢節(jié)551700）

水稻在我國農(nóng)作物中具有重要的地位， 是最主要的糧食作物之一， 我國60%以上的人口以稻米為主食。 稻米中蛋白質(zhì)占 8%～10%，根據(jù)其溶解特性，可分為4 種， 即清蛋白、 球蛋白、 醇溶蛋白和谷蛋白[1]，以谷蛋白含量最高，約占總蛋白的80%，也是人體最易于消化吸收的蛋白成分，因此，可通過提高谷蛋白含量來增加稻米的營養(yǎng)價值。 然而，對于患有腎臟疾病的病人來說， 攝入大量的可吸收性蛋白會增加腎臟負擔，導致人體蛋白代謝紊亂，進而造成病情惡化。 近年來，隨著腎臟病患者人數(shù)不斷增多，低谷蛋白含量水稻品種越來越受到人們的關注， 培育綜合性狀優(yōu)良的低谷蛋白新品種已成為當前功能性水稻育種的一個重要方向。

日本學者通過誘變獲得一個低谷蛋白突變體，該控制基因命名為Lgc1，將該突變體進行雜交，培育出世界第一個低谷蛋白水稻品種LGC1。 萬建民等[2]引入LGC1 品種作為育種親本，培育出了我國第一個低谷蛋白水稻品種W3660。 此后， 在我國水稻育種界，以含低谷蛋白基因Lgc1材料為親本，選育出了一些低谷蛋白水稻新品種[3-7]。

本研究以從江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所引進的含低谷蛋白基因Lgc1的材料L06 為親本，與課題組選育的12095B 進行雜交組配，后代在田間選擇中，結(jié)合筆者[8]早年參與開發(fā)的Lgc1基因功能標記鑒定，選育出了低谷蛋白新品系，命名為TL0695。 該新品系綜合性狀優(yōu)良、豐產(chǎn)性好，具有重要的應用價值，筆者將對其選育情況進行簡述。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

母本：2014 年從江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所引進的含低谷蛋白基因Lgc1的材料L06。

父本：筆者課題組選育的保持系12095B。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻DNA 的提取 水稻分蘗盛期， 單株掛牌， 取葉片， 將所取的葉片存于冰箱-20℃下備用。DNA 提取參照田孟祥等[9-11]的方法進行。

1.2.2 分子標記檢測 分子標記及檢測方法參照筆者[8]參與開發(fā)的Lgc1基因功能標記所述的方法進行。Lgc1基因功能標記由2 對引物構成， 即InDel-Lgc1-1和 InDel-Lgc1-2。 InDel-Lgc1-1： 正向引物序列5′-TTCTACAATGAAGGCGATGC-3′， 反向引物序列5′-CTGGGCTTTAACGGGACT-3′。 InDel-Lgc1-2：正向引物序列5′-ACCGTGTTATGGCAGTTT-3′，反向引物序列 5′-ATTCAAGGGCTATCGTCT-3′。 根據(jù)標記特性， 含純合低谷蛋白Lgc1基因擴增881 bp 的帶型，不含低谷蛋白基因擴增509 bp 的帶型，而雜合體則擴增出以上2 種帶型。

1.2.3 稻米谷蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍G-250 法進行稻米谷蛋白含量測定， 具體參照王艷平等[1]的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 低谷蛋白新品系的選育過程

2014 年畢節(jié)正季以低谷蛋白種質(zhì)L06 為母本，以12095B 為父本進行雜交，獲F1，同年冬繁種于海南，移栽 20 株，成熟后種子混收，為 F2；2015 年畢節(jié)正季種植F2，移栽種植600 株，單株種植，掛牌，取葉片進行分子標記檢測，熟后選農(nóng)藝性狀優(yōu)良單株，收單穗，結(jié)合分子標記檢測結(jié)果，留含目標基因植株的種子，15 個單穗，將種子互混保存，為F3，同年冬繁種于海南，移栽種植500 株，單株種植，掛牌，單株取葉片進行分子標記檢測，熟后選農(nóng)藝性狀優(yōu)良單株，收單穗，結(jié)合分子標記檢測結(jié)果，留含目標基因植株的種子，20 個單穗，互混保存，為 F4；2016 年畢節(jié)正季種植F4，移栽400 株，單株種植，掛牌，單株取葉片進行分子標記檢測， 熟后選農(nóng)藝性狀優(yōu)良單株， 收單穗，結(jié)合分子標記檢測結(jié)果，留含目標基因植株的種子，10 個單穗，單穗保存，為F5，同年冬繁種于海南，10 個單穗種植成10 個小區(qū)，每小區(qū)100 株，田間選擇與分子標記輔助選擇相結(jié)合，收單穗12 個，為F6；2017 年畢節(jié)正季種植F6，12 個單穗種成12 個小區(qū)，每小區(qū)100 株， 田間選擇與分子標記輔助選擇相結(jié)合，收單穗8 個，為F7，同年冬繁種于海南，8 個單穗種植成8 個小區(qū)，每小區(qū)100 株，田間選擇與分子標記輔助選擇相結(jié)合，收獲單穗10 個，為F8；2018 年正季種植 F8，10 個單穗種植成 10 個小區(qū)， 收獲 8 個單穗，經(jīng)分子標記鑒定確認含目標基因，為F9，遺傳穩(wěn)定，同年海南南繁進行擴繁；2019 年正季參加品比試驗，篩選出表現(xiàn)突出品系4 個；2020 年將上年4 個表現(xiàn)好的品種再參加品比試驗， 最終選留綜合表現(xiàn)最突出的低谷蛋白新品系1 個，暫定名為TL0695。

2.2 低谷蛋白基因分子標記鑒定

在低谷蛋白新品系選育過程中， 從基因分離的F2世代開始，應用Lgc1基因功能標記對目標基因進行跟蹤。 低谷蛋白基因功能標記對F2群體植株的檢測情況見附圖，后面世代的檢測大致與其相似，不再累贅。 由附圖可知，L06/12095B 的 F2群體植株，在編號為 3～19 的單株中，編號為 10、11、13、14 僅有一條大小為881 bp 的帶型，與親本L06 的帶型一致，是含低谷蛋白Lgc1純合基因的植株；編號為 3、5、12、15、17 僅有一條大小為509 bp 的帶型， 與親本12095B的帶型一致，是谷蛋白正常的植株；而編號為4、6、7、8、9、16、18、19 同時出現(xiàn) 881 bp 和 509 bp 的帶型，為以上兩類型植株的雜合體。

附圖 低谷蛋白Lgc1 基因功能標記對L06/12095B 的F2 群體植株的檢測

2.3 低谷蛋白含量測定

通過田間選擇和分子標記輔助選擇相結(jié)合，選育成了低谷蛋白新品系TL0659， 為了解其低谷蛋白的具體含量， 采用考馬斯亮藍 G-250 法測定其中堿溶性蛋白（谷蛋白）含量。 測定結(jié)果顯示，所育成的低谷蛋白新品系TL0659 的谷蛋白含量為3.11%， 略低于母本 L06 的含量（3.28%），遠低于父本 12095B 的含量（6.71%）。

2.4 低谷蛋白新品系農(nóng)藝性狀調(diào)查

對低谷蛋白新品系TL0659 的農(nóng)藝性狀進行調(diào)查。 在貴州省畢節(jié)市， 全生育期為 165.2 d， 株高108.2 cm， 株葉型好， 莖稈較堅韌， 葉色濃綠， 劍葉直立， 葉鞘、 葉緣綠色； 分蘗力中等， 畝有效穗17.5 萬穗；半直立穗，穗型較大，穗粒數(shù)為168.2 粒，結(jié)實率92.2%，千粒重26.5 g。 粒型闊卵形，穎尖無色、 無芒、 后期轉(zhuǎn)色好。 2019 年品比試驗折合畝產(chǎn)526.3 kg，2020 年品比試驗折合畝產(chǎn) 542.7 kg， 豐產(chǎn)性好，應用前景廣闊。

3 討論

日本選育出了第一個低谷蛋白水稻品種LGC-1，其可溶性蛋白含量低于4%，將該稻米用于腎臟病患者的臨床試驗。結(jié)果表明，以LGC-1 為主食的患者蛋白質(zhì)攝入量和血清肌酸酐含量明顯降低 （與食用低蛋白代用品效果相同），患者病情得到明顯改善。 因此，可溶性蛋白低于4%的稻米被認為是對腎病患者（尤其以大米為主食者） 非常有效的食療輔助品，培育低谷蛋白功能性水稻品種不僅給腎臟病人帶來了福音，也給予了育種者良好的契機。 萬建民等[2]選育出了中國第一個低谷蛋白品種W3660，此后，在中國水稻育種界掀起了低谷蛋白育種潮， 篩選低谷蛋白種質(zhì)資源或利用已有的低谷蛋白種質(zhì)進行育種研究。2008 年在江蘇，筆者就跟隨團隊進行低谷蛋白種質(zhì)篩選和育種實踐， 開發(fā)出了針對低谷蛋白基因Lgc1的 2 種功能標記[8,12]。 2010 年回到貴州工作，又開展了低谷蛋白育種研究， 以含低谷蛋白基因Lgc1的W3660 為親本，與貴州多個粳稻品種雜交，但后代普遍表現(xiàn)太差， 選育低谷蛋白品種失敗， 或許與W3660 在貴州表現(xiàn)太差相關。

分子標記輔助選擇已經(jīng)成為水稻育種的一個重要輔助手段，基于基因DNA 序列的功能標記，更是能準確、簡便、高效地對目標基因進行鑒定，具有不受環(huán)境條件影響、提高選擇效率的明顯優(yōu)勢。 項目組以江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所引進低谷蛋白材料L06 為母本，以自育的粳稻保持系12095B 為父本，進行雜交組配，采用田間選擇和分子標記輔助選擇相結(jié)合，高效地選育出了綜合性狀好、豐產(chǎn)性好的低谷蛋白粳稻新品系， 為貴州低谷蛋白水稻生產(chǎn)和種質(zhì)創(chuàng)新提供了優(yōu)良種質(zhì)材料。