多子小瓜蟲對三種化學(xué)藥物的敏感性研究

李雪菡，齊紅莉，呂湘琳，楊廣

多子小瓜蟲對三種化學(xué)藥物的敏感性研究

李雪菡，齊紅莉通信作者，呂湘琳，楊廣

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392）

對從錦鯉（）分離出的多子小瓜蟲（）采用離體單克隆培養(yǎng)，選用硫酸銅和硫酸亞鐵合劑（5∶2）、高錳酸鉀溶液及福爾馬林，3種化學(xué)藥物探究其對多子小瓜蟲的致死情況。結(jié)果表明：3種藥物濃度均與多子小瓜蟲的死亡率存在正相關(guān)趨勢，且5.6 mg/L的硫酸銅和硫酸亞鐵合劑、8 mg/L的高錳酸鉀溶液、120 mg/L的福爾馬林都能全部致死多子小瓜蟲；多子小瓜蟲對3種化學(xué)藥物的敏感性為：硫酸銅、硫酸亞鐵合劑＞高錳酸鉀溶液＞福爾馬林。研究結(jié)果在一定程度為小瓜蟲病的治療及預(yù)防提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持和試驗基礎(chǔ)。

多子小瓜蟲；硫酸銅、硫酸亞鐵合劑；高錳酸鉀溶液；福爾馬林；敏感性

多子小瓜蟲（）隸屬于原生動物門（Protozoa），寡膜纖毛綱（Oligohy- menophorea），膜口目（Hymenostomatida），凹口科（），小瓜蟲屬（）[1-3]，由FOUQUET在1876年正式命名[4]，是養(yǎng)殖魚類最常見的寄生蟲之一[5-8]，具有生長繁殖快、分布范圍廣、營寄生[6，9]等特點，對國內(nèi)外的養(yǎng)殖魚類造成極大的影響[10-11]。多子小瓜蟲生活史主要為幼蟲期、包囊期和成蟲期[6，10-13]，因幼蟲具感染性，當(dāng)其從包囊中孵化后，會尋找宿主并鉆入宿主表皮內(nèi)[9，14-15]，一般多寄生在魚口、頭、鰓、眼及皮膚等部位[9]。魚類感染后，患病魚體表面會出現(xiàn)大量肉眼可見的小白點，因此小瓜蟲病亦稱“白點病”[15-16]。此病發(fā)病傳染快，死亡率高[13]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[12-14]。在缺氧、水溫不斷升高、魚類繁殖或擁擠的養(yǎng)殖環(huán)境中，不流動的小水體及集約化養(yǎng)殖中都極易爆發(fā)小瓜蟲病[7，9，16]。我國小瓜蟲病的流行季節(jié)一般為每年4-5月和11-12月[12-13]，水溫18～23 ℃時易爆發(fā)小瓜蟲 病[10-12]，此病是養(yǎng)殖漁業(yè)一大難題，國內(nèi)外許多學(xué)者都圍繞其病原性、形態(tài)、生活史、免疫及防治等方面開展了大量的科學(xué)研究[15]，目前主要防治手段為物理防治如改變水體溫度[11-12]、pH和鹽度[17]等方法；或是化學(xué)防治如使用化學(xué)藥物如福爾馬林[18]、姜黃素（Curcumin）[19]、單寧酸（Tannic Acid）[20]；或是使用其他簡易藥物進(jìn)行治療如生姜辣椒合劑、五倍子、生石灰等[5-6]；或是疫苗防治如制備小瓜蟲病疫苗等[6]。

本試驗采用對多子小瓜蟲幼蟲的離體單克隆培養(yǎng)，選用三種常用于觀賞魚的藥物即硫酸銅和硫酸亞鐵合劑（5∶2）、高錳酸鉀溶液以及福爾馬林作用于離體多子小瓜蟲，從而研究其藥物敏感性，為小瓜蟲病的治療及預(yù)防提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗材料為天津農(nóng)學(xué)院觀賞魚實驗室患多子小瓜蟲病的錦鯉。小牛血清（MP20005-100 mL，天津百奧泰科技發(fā)展有限公司），牛肉凈膏液，硫酸銅（JK000740，天津百奧泰科技發(fā)展有限公司），硫酸亞鐵（KM0-103，天津艾利安電子科技有限公司），高錳酸鉀（JL5857，天津市河西區(qū)順鑫意發(fā)五金交電），甲醛（JK000394，天津百奧泰科技發(fā)展有限公司）。

將硫酸銅和硫酸亞鐵各自用蒸餾水溶解，再按5∶2的比例混合，獲得硫酸銅和硫酸亞鐵合 劑[21-22]。高錳酸鉀、福爾馬林根據(jù)試驗要求配置成不同濃度溶液備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 小瓜蟲的離體培養(yǎng)與觀察

收集病魚體表的多子小瓜蟲，使用細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。加入20 mL牛肉凈膏液和2 mL小牛血清[23]，輕微振蕩后，放至24 ℃生化培養(yǎng)箱中，進(jìn)行單克隆大量繁殖[7]。定時用倒置顯微鏡觀察多子小瓜蟲的生長情況，當(dāng)水體中蟲體密度超過30 000 ind/mL時，進(jìn)行攻毒試驗。

1.2.2 三種藥物的濃度設(shè)置

經(jīng)預(yù)試驗，本試驗硫酸銅和硫酸亞鐵合劑 （5∶2）設(shè)置的藥物質(zhì)量濃度分別是0、0.7、1.4、2.8、5.6 mg/L，共5個，高錳酸鉀濃度分別是0、1、2、4、8 mg/L，共5個，福爾馬林濃度分別是0、30、60、90、120 mg/L，共5個。每個濃度梯度組設(shè)三個平行，每組藥品各設(shè)生理鹽水組作為空白對照組。分別在0、0.5、1.0、12.0、24.0、36.0、48.0 h，進(jìn)行全板計數(shù)，每孔計數(shù)3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理分析

在倒置顯微鏡下觀察各組藥物作用下離體多子小瓜蟲的死亡數(shù)量并計算其死亡率（%），死亡率取平均值后利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對不同試驗組的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD法多重比較，試驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 空白對照組多子小瓜蟲的生長率

試驗表明，在不加任何藥物，即正常生長的情況下，多子小瓜蟲的個體數(shù)量隨著時間推移逐漸增加，基本沒有死亡，多子小瓜蟲的生長率基本呈現(xiàn)正增長趨勢。

2.2 硫酸銅和硫酸亞鐵合劑（5∶2）對離體多子小瓜蟲的急性毒性研究

由表1可知，在較低濃度的硫酸銅和硫酸亞鐵合劑（0.7 mg/L）作用攻毒后的12.0 h之內(nèi)，離體小瓜蟲的死亡率呈增長趨勢，在12.0 h時達(dá)到33.30%，但是隨著時間推移，離體小瓜蟲的死亡率開始出現(xiàn)下降和起伏，并于48.0 h后達(dá)到最低值，僅為11.10%。當(dāng)藥物以較高濃度（1.4、2.8 mg/L）作用時，試驗各時段的離體小瓜蟲死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢，在藥物作用濃度達(dá)到2.8 mg/L時，48.0 h后離體小瓜蟲的死亡率高達(dá)90.00%，但仍不能全部死亡，當(dāng)藥物作用濃度達(dá)到最高濃度（5.6 mg/L），0.5 h時離體小瓜蟲的死亡率為31.10%，顯著高于其他作用濃度相同時間下的死亡率，隨后各時間段的死亡率一直處于上升階段；歷經(jīng)48.0 h后，其死亡率達(dá)100.00%。結(jié)合以上數(shù)據(jù)表明，硫酸銅和硫酸亞鐵合劑的濃度為5.6 mg/L時，其作用于多子小瓜蟲是最適宜的，離體小瓜蟲全部致死。由表1可知，0.5 h時高濃度試驗組無顯著差異。藥物作用1.0 h時，空白對照組與高濃度5.6 mg/L的試驗組之間具有顯著差異（＜ 0.05）。在12.0 h時空白對照組和其他濃度試驗組均存在顯著差異（＜0.05）。24 h時，0.7 mg/L濃度組和其他高濃度組均存在顯著差異（＜0.05）。36.0 h時，各試驗組之間均存在顯著差異（＜0.05）。48.0 h時0.7mg/L濃度組和其他高濃度組均存在顯著差異（＜0.05）。

表1 硫酸銅和硫酸亞鐵合劑對離體多子小瓜蟲的死亡率及其平均值比較分析

注：表中字母不同表示相同時間不同濃度差異顯著（＜0.05）。下同

2.3 高錳酸鉀溶液對離體多子小瓜蟲的急性毒性研究

由表2可知，離體小瓜蟲對高錳酸鉀藥物較為敏感，藥物作用1 h時，4個試驗組均有死亡。當(dāng)濃度低于4 mg/L時，攻毒后的1～36 h內(nèi)，其死亡率高低變化。當(dāng)高錳酸鉀溶液作用濃度為 1 mg/L時，藥物對多子小瓜蟲作用的死亡率均不足50.00%。作用濃度為2 mg/L時，24 h多子小瓜蟲的死亡率可達(dá)53.30%。作用濃度為4 mg/L時，48 h雖不能全部殺死多子小瓜蟲，但多子小瓜 蟲的死亡率已提高至94.40%。而當(dāng)藥物濃度為 8 mg/L時，多子小瓜蟲的死亡率呈上升趨勢，多子小瓜蟲于48 h時全部死亡。

表2 高錳酸鉀對離體多子小瓜蟲的死亡率及其平均值比較分析

表2顯示作用濃度為1 mg/L的試驗組中藥物對小瓜蟲的作用效果隨時間增加而降低，在作用濃度為2、4、8 mg/L的試驗組中隨著作用時間延長，高錳酸鉀溶液對離體小瓜蟲的作用效果增強，多子小瓜蟲的死亡率增加。當(dāng)藥物作用0.5 h時，在1、2、4、8 mg/L濃度的試驗組與對照組差異均不顯著（＞0.05）。當(dāng)藥物作用1 h時，空白對照組與藥物濃度為2、4、8 mg/L時差異均顯著（＜ 0.05）。隨著作用時間繼續(xù)增加，藥物濃度為2、4、8 mg/L時與空白對照組間差異均顯著（＜ 0.05）。當(dāng)高錳酸鉀溶液作用濃度為1 mg/L時，在12 h內(nèi)能刺激多子小瓜蟲生長，但其增長速度較慢。

2.4 福爾馬林對離體小瓜蟲的急性毒性研究

由表3可知，當(dāng)福爾馬林作用濃度為30 mg/L時，在0.5～1.0 h，離體小瓜蟲死亡率顯著上升，1 h時達(dá)到54.4%，但隨著攻毒時間增加，其死亡率逐漸下降，48 h時死亡率下降至22.20%，和攻毒0.5 h時的死亡率相同，以此推斷較低濃度的福爾馬林對多子小瓜蟲沒有顯著的作用效果。當(dāng)福爾馬林作用濃度大于60 mg/L時才具有明顯殺蟲效果，濃度大于90 mg/L時作用效果明顯。當(dāng)福爾馬林作用濃度為60、90、120 mg/L時，隨時間增長，多子小瓜蟲的死亡率不斷上升。在1 h時，濃度為120 mg/L的試驗組與空白對照組差異顯著 （＜0.05）。12 h時空白對照組和30 mg/L試驗組的多子小瓜蟲死亡率與60、90、120 mg/L 3組試驗組之間差異顯著（＜0.05）。24、36、48 h空白對照組與其他試驗組均有顯著差異（＜0.05）。當(dāng)藥物作用濃度為30 mg/L時，福爾馬林對多子小瓜蟲的殺滅效果在1 h時達(dá)到頂峰，隨后作用效果開始下降。

表3 福爾馬林對離體多子小瓜蟲的死亡率及其平均值比較分析

3 討論

3.1 硫酸銅和硫酸亞鐵合劑（5∶2）對離體小瓜蟲的殺死效果

小瓜蟲病是目前國內(nèi)外最為棘手的魚類疾病之一[14]，小瓜蟲通過寄生于魚類，引起其體表各組織充血并減低免疫力，導(dǎo)致魚類被細(xì)菌、病毒感染，造成大批死亡，嚴(yán)重影響魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)[18]。硫酸銅、硫酸亞鐵合劑對多子小瓜蟲體外培養(yǎng)攻毒試驗中，用0.7 mg/L的硫酸銅和硫酸亞鐵合劑作用于小瓜蟲后，12.0 h后蟲子數(shù)量不斷升高，多子小瓜蟲死亡率下降，說明低濃度的硫酸銅和硫酸亞鐵合劑作用下不能有效抑制多子小瓜蟲生長，更達(dá)不到殺滅多子小瓜蟲的效果。當(dāng)作用濃度為1.4 mg/L時，48.0 h時多子小瓜蟲的死亡率可達(dá)78.90%。當(dāng)作用濃度為2.8 mg/L時，藥物作用48.0 h內(nèi)可以殺死高達(dá)90.00%的多子小瓜蟲。硫酸銅和硫酸亞鐵合劑作用時能殺死寄生在魚類體表的許多寄生蟲，殺滅體外寄生蟲時硫酸銅起主要作用，而硫酸亞鐵一般為輔助藥物具有收斂作用，輔助硫酸銅殺死蟲體[24]。一般情況下，通常使用硫酸亞鐵輔助硫酸銅殺滅一些比較難殺滅的寄生蟲。硫酸銅和硫酸亞鐵合劑在作用于小瓜蟲過程中，Cu2＋與蟲體蛋白質(zhì)形成螯合物，使蛋白質(zhì)變性、沉淀，繼而使多子小瓜蟲體內(nèi)的酶失去活力，影響小瓜蟲的正常生長，從而達(dá)到殺死多子小瓜蟲的目的[25]。李光照[26]認(rèn)為在防治車輪蟲（）病時，選擇全池潑灑0.5 g/m3硫酸銅和0.2 g/m3硫酸亞鐵合劑的使用劑量是安全有效的。張濤等[27]在對四種常用水產(chǎn)藥物對菲牛蛭（）急性毒性的研究中闡明硫酸銅、硫酸亞鐵合劑及高錳酸鉀溶液的半致死濃度會隨時間的延長而降低。硫酸銅、硫酸亞鐵合劑對菲牛蛭殺死效果要比高錳酸鉀溶液明顯，其半致死濃度分別為1.91 mg/L和4.17 mg/L，安全濃度為0.59 mg/L和0.62 mg/L。LINK等[28]研究銅離子對魚類多子小瓜蟲致死濃度的確定，銅離子對小瓜蟲LC50為0.288 mg/L。因此硫酸銅的實際用量（以CuSO4·5H2O計算）不能低于1.14 mg/L。黃斌等[18]在不同藥物對金魚小瓜蟲病的防治效果的試驗表明只有當(dāng)硫酸銅、硫酸亞鐵合劑濃度大于1.2 mg/L（半致死濃度）時，對多子小瓜蟲才有殺死作用。在本試驗中，通過硫酸銅、硫酸亞鐵合劑對多子小瓜蟲體外培養(yǎng)的攻毒試驗，用0.7 mg/L硫酸銅、硫酸亞鐵合劑作用于小瓜蟲，12 h后蟲子數(shù)量不斷升高，多子小瓜蟲死亡率下降，說明低于半致死濃度的硫酸銅和硫酸亞鐵合劑不能起到完全毒殺離體多子小瓜蟲的效果。

3.2 高錳酸鉀溶液對離體小瓜蟲的殺死效果

高錳酸鉀又稱灰猛氧、過錳酸鉀等，是一種強氧化劑，可氧化細(xì)菌表面的氧化膜，使細(xì)菌溶解，蛋白活性失活，用來殺滅多種寄生蟲和病害生物[29-31]，或利用魚類與高錳酸鉀短時間接觸來防止魚類感染病原[32]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行高錳酸鉀對離體小瓜蟲的攻毒試驗時，當(dāng)作用濃度為 1 mg/L時，高錳酸鉀溶液對多子小瓜蟲沒有致死作用，反而促進(jìn)蟲體的生長。當(dāng)作用濃度為2 mg/L時，12 h時高錳酸鉀沒有明顯殺死離體小瓜蟲的效果，在24 h時多子小瓜蟲的死亡率才43.30%，當(dāng)作用濃度為4 mg/L時，48 h時多子小瓜蟲的死亡率可達(dá)94.40%。陳達(dá)麗等[1]在殺滅離體小瓜蟲的藥物試驗中提到，高錳酸鉀濃度在2～5 mg/L時，有殺死多子小瓜蟲作用，與本試驗結(jié)果基本吻合。當(dāng)作用濃度為8 mg/L時，藥物作用效果隨時間增加而增強，48 h時，多子小瓜蟲的死亡率為100.00%。

3.3 福爾馬林對離體小瓜蟲的殺死效果

30%～40%的甲醛水溶液稱為福爾馬林，作用于細(xì)胞時能阻止細(xì)胞核蛋白的合成，抑制細(xì)胞核和細(xì)胞漿的合成以及細(xì)胞分裂，影響細(xì)胞正常生命活動，使微生物死亡。福爾馬林能有效殺死細(xì)菌繁殖體，也能殺死芽孢以及抵抗力強的結(jié)核桿菌、病毒等[33-36]。福爾馬林作用濃度為60 mg/L時，48 h能殺死82.2%的小瓜蟲。作用濃度為90 mg/L的藥物可以在48 h殺死98.9%的小瓜蟲，當(dāng)福爾馬林濃度大于60 mg/L時才達(dá)到殺死多子小瓜蟲的效果。高莉霞等[37]研究化學(xué)藥物對鱖魚車輪蟲（）病、斜管蟲（）病的影響與防治時，發(fā)現(xiàn)低濃度硫酸銅和硫酸亞鐵合劑無有效作用，高于2.8 mg/L時餌料魚全部死亡，因此福爾馬林對車輪蟲病、斜管蟲病的治療效果要優(yōu)于硫酸銅以及硫酸銅和硫酸亞鐵合劑。黃斌等[18]在不同藥物對金魚小瓜蟲病的防治效果研究中，使用福爾馬林（40～50 mg/L）作用100～125 min時對多子小瓜蟲病的防治效果較好。

4 結(jié)論

通過比較硫酸銅和硫酸亞鐵合劑、高錳酸鉀、福爾馬林對離體小瓜蟲的作用效果，發(fā)現(xiàn)三種化學(xué)藥物對多子小瓜蟲都有一定的抑制作用，隨著藥物濃度升高和藥浴時間延長，存活的小瓜蟲越來越少，死亡率升高。由死亡率計算得出，多子小瓜蟲對三種化學(xué)藥物的敏感性大小依次為：硫酸銅和硫酸亞鐵合劑＞高錳酸鉀溶液＞福爾馬林。

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Study on the sensitivity ofto three chemical drugs

LI Xuehan, QI HongliCorrespondingAuthor, Lü Xianglin, Yang Guang

（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

In this study,isolated fromwas in vitro monoclonal culture, using mixture of copper sulfate and ferrous sulfate（5∶2）, aqueous solution of potassium permanganate and formalin to explore the mortality to.The results showed that the concentration of the three drugs is positively correlated with the mortality of, and 5.6 mg/L of copper sulfate and ferrous sulfate mixture, 8 mg/L potassium permanganate aqueous solution and 120 mg/L formalin can kill all of the.The sensitivity of theto these three chemical drugs: Copper sulfate and Ferrous sulfate mixture＞Potassium permanganate aqueous solution＞Formalin.The research results provide corresponding theoretical data and experimental basis for the treatment and prevention ofdisease to a certain extent.

; copper sulfate and ferrous sulfate mixture（5∶2）; potassium permanganate aqueous solution; formalin; sensitivity

1008-5394（2021）03-0069-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.015

S931.1

A

2019-09-30

天津市科委自然基金項目（17JCYBJC29800，15JCYBJC23900）；中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室開放課題（KLM2018003）

李雪菡（1994—），女，碩士在讀，主要從事原生動物學(xué)的研究。E-mail：1552897312@qq.com。

齊紅莉（1978—），女，副教授，碩士，主要從事水生態(tài)毒理學(xué)及原生動物學(xué)的研究。E-mail：qihl2000@163.com。

責(zé)任編輯：張愛婷