艾草抑菌抗炎作用研究

陳文東

(隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅，成縣 742500 ）

艾草（Artemisia Argyi）又名艾蒿，為半灌木狀菊科蒿屬，多年生草本植物[1]。別名蕭茅、冰臺、艾絨等，莖褐色或灰黃褐色，全草入藥，它是一種具有藥用和食用價(jià)值的多功能植物，藥源豐富，毒性較低，具有廣泛的開發(fā)利用價(jià)值[2]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，艾草具有溫經(jīng)、祛濕、抗過敏、散寒、平喘、消炎、止咳、止血、安胎等作用[3-4]。

腹瀉是動物養(yǎng)殖業(yè)中最常見的一種胃腸道疾病，如果不能及時的治療，會引起動物生長速度減慢、產(chǎn)蛋率下降等，嚴(yán)重時可引起動物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。引起動物腹瀉的致病菌主要為大腸桿菌，對幼畜禽危害最為嚴(yán)重。目前，臨床上主要使用抗生素進(jìn)行治療腹瀉，在取得一定治療效果的同時也帶來了細(xì)菌耐藥性、獸藥殘留和病情易復(fù)發(fā)等問題。因此，本研究以艾草為研究對象，初步探討艾草水煎液的抑菌抗炎作用，以期為研究和開發(fā)高效、低毒、低殘留的純中藥制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、菌種和培養(yǎng)基

艾草（采自隴南師專梁山校區(qū)）、阿司匹林（拜耳醫(yī)藥）、速眠新（拜特）、大腸桿菌（由本實(shí)驗(yàn)室從隴南機(jī)場受傷的灰鶴糞便內(nèi)分離鑒定）、肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和血瓊脂平板（按微生物教材配制）。

1.2 試劑和儀器

伊文斯蘭（Evans Blue，博美）、二甲苯（隆昌）、無水乙醇（富宇）、乙酸（河南化工研究所）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ZFY-2L，科興）、分光光度計(jì)（SP-723 PC，光譜）、分析天平（FA2004N，上海精密科學(xué)儀器）、電熱式壓力蒸汽滅菌器（XFH-50MA，新豐）、鼓風(fēng)干燥箱（NJ101-4A，天泰）、粉碎機(jī)（32000 r/min，鉑歐）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

昆明系小白鼠，雌雄各半，體重30～35 g（購自蘭州獸醫(yī)研究所）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 艾草水煎液制備[5]

用粉碎機(jī)將曬干后的50 g 艾草粉成粉末狀，加蒸餾水500 mL，充分混勻，浸泡30 min 后用電爐煮沸，煮沸后改用溫火煎30 min，用八層紗布過濾，如此反復(fù)煎煮兩次。合并兩次濾液分裝于15 mL 離心管內(nèi)1500 r/min 離心5 min，去掉底層沉渣，將水煎液濃縮至50 mL（含藥量1.0 g/mL），121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌半小時，密封，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 體外抑菌作用

1.4.2.1 細(xì)菌懸液制備

超凈臺內(nèi)無菌操作，將9 支試管分別加入9 mL無菌生理鹽水，用記號筆依次標(biāo)記為1～9。在1 號試管內(nèi)加入1.0 mL 菌液，吹打均勻，再從1 號試管內(nèi)吸取1.0 mL 混合后的菌液至2 號試管內(nèi)，以此類推，直至9 號試管。

取20 個普通瓊脂平板，平均分成5 組，分別標(biāo)記5、6、7、8、9，將5～9 號試管內(nèi)的菌液分別加入對應(yīng)的平板內(nèi)，每個平板加100 μL，用涂布棒把菌液涂均勻，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)。將菌液濃度調(diào)整為5×106CFU/mL。置于4℃冰箱備用。

1.4.2.2 試管二倍稀釋法

超凈臺內(nèi)無菌操作，取10 支無菌試管，編號1～10，每支編號試管重復(fù)5 次，在前9 支試管中分別加入2 mL 普通肉湯培養(yǎng)基，再在1 號試管中加艾草水煎液2 m L，吹打均勻，從1 號試管中吸出2 mL 加到2 號試管中，按此稀釋藥液至8 號試管。9 號試管為陽性對照，不加藥液，10號試管為陰性對照，只加入2 m L 艾草水煎液。在上述1～9 號試管內(nèi)各加100 μL細(xì)菌懸液，10 號試管內(nèi)加100 μL生理鹽水，振蕩器上混合均勻，37℃培養(yǎng)24 h，觀察各試管渾濁狀態(tài)并記錄結(jié)果。

結(jié)果判定：在陽性對照試管呈渾濁狀，陰性對照試管呈透明狀的前提下，觀察其余試管內(nèi)細(xì)菌生長情況，以不變渾濁的最低藥液濃度作為艾草水煎液的MIC，從確定MIC 的試管內(nèi)吸取培養(yǎng)液，涂布于普通瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察平板內(nèi)細(xì)菌生長情況并計(jì)數(shù)。結(jié)果判定：瓊脂平板內(nèi)菌落數(shù)不超過5 個的最低濃度為艾草水煎液的MBC。

1.4.2.3 牛津杯法

超凈臺內(nèi)無菌操作，在普通瓊脂平板上加100 μL菌液，涂布棒涂均勻。在平板內(nèi)均勻放置4 個牛津杯，牛津杯中分別加入250 μL不同濃度的艾草水煎液，濃度分別為1、0.5、0.25、0.125 g/mL，每個藥液濃度重復(fù)4 次。于4℃冰箱放置半小時，再放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測定抑菌圈大小，并以抑菌圈大小和有無來評價(jià)藥物抑菌活性。

效果判定：直徑：≥20 mm，極敏感；20 mm＞直徑≥15 mm，高度敏感；15 mm＞直徑≥10 mm，中度敏感；直徑＜10 mm，低敏感或無效。

1.4.3 抗炎作用

1.4.3.1 乙酸致小白鼠毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)[6]

將50 只小白鼠平均分成5 組，各組內(nèi)小白鼠雌雄各半，禁食24 h 后，開始灌服艾草水煎液，每日1 次，連續(xù)7 d。第一組為艾草水煎液高濃度組（0.2 g/mL），第2 組為艾草水煎液中濃度組（0.1 g/mL），第三組為艾草水煎液低濃度組（0.05 g/mL），第四組為陽性對照組（阿司匹林，0.001 g/mL），第五組為空白對照組（生理鹽水），每組灌藥量為10 mL/kg。第7 d 灌藥12 h 后，在小白鼠尾靜脈注射伊文斯蘭水溶液（1 g/L），注射量為0.1 mL/10 g，然后小白鼠腹腔注射冰乙酸溶液致炎，30 min 后將小白鼠斷頸處死，再在腹腔內(nèi)注射生理鹽水5 mL，按摩小白鼠腹部數(shù)分鐘后，解剖小白鼠，吸取腹腔內(nèi)液體到離心管中，3000 r/min 離心10 min，收取上清液，在590 nm 波長下測定OD 值，用OD 值表示小白鼠毛細(xì)血管滲出伊文斯蘭的量，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算毛細(xì)血管通透性抑制率。

計(jì)算方法：通透性抑制率＝（空白組平均OD值－藥物組平均OD 值）/空白組平均OD 值×100%。

1.4.3.2 二甲苯致小白鼠耳腫脹試驗(yàn)[6-7]

小白鼠分組及灌藥方法同1.4.3.1 方法，第7d灌藥12 h 后，在每只小白鼠的左耳廓滴涂二甲苯致炎，右耳作空白對照，30 min 后將小白鼠斷頸處死，接著用打孔器在左、右耳廓對稱位置打下耳片，電子分析天平稱重，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算耳腫脹抑制率和腫脹度。

計(jì)算方法：耳腫脹度=左耳片質(zhì)量-右耳片質(zhì)量；腫脹抑制率=（空白組平均腫脹度-藥物組平均腫脹度）/空白組平均腫脹度×100%。

1.4.3.3 小白鼠棉球肉芽腫試驗(yàn)[6]

小白鼠分組同1.4.3.1 方法。肌肉注射麻醉小白鼠，在小白鼠腹股溝皮下埋植無菌脫脂棉球。手術(shù)24 h 后開始給小白鼠灌服藥液，灌藥方法同1.4.3.1。第7 d 灌藥12 h 后，將小白鼠斷頸處死，分離出腹股溝處的脫脂棉球，在60℃干燥箱內(nèi)烘干至恒重，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算肉芽腫質(zhì)量和增生抑制率。

計(jì)算方法：肉芽腫質(zhì)量=棉球肉芽腫質(zhì)量-原棉球質(zhì)量；增生抑制率=（空白組肉芽腫平均質(zhì)量-藥物組肉芽腫平均質(zhì)量）/空白組肉芽腫平均質(zhì)量×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS18.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±SE)”表示；用單因子方差分析(One-way ANOVA,LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌作用

四個濃度的艾草水煎液作用于大腸桿菌。結(jié)果表明，1.0、0.5、0.25 g/mL 的艾草水煎液對大腸桿菌具有一定的抑制作用，且濃度越高，抑菌效果越好。1.0 g/mL 艾草水煎液的抑菌直徑大于15 mm，為高度敏感；0.5 g/mL 艾草水煎液的抑菌直徑大于10 mm，為中度敏感；0.25、0.125 g/mL 艾草水煎液的抑菌直徑小于10 mm，為低度敏感（表1）。艾草水煎液對致病型大腸桿菌的MIC 為0.125 g/mL，MBC 為0.25 g/mL，表明艾草對致病型大腸桿菌具有一定的抑菌和殺菌作用（表2）。

表1 艾草的抑菌直徑（mm）Table 1 The inhibition zone diameter of Artemisia Argyi

表2 艾草的MBC 和MIC（g/mL）Table 2 The MBC and MIC inhibition of Artemisia Argyi

2.2 抗炎作用

艾草水煎液對小白鼠毛細(xì)血管通透性的影響結(jié)果見表3；艾草水煎液對二甲苯致小白鼠耳腫脹的影響的結(jié)果見表4；艾草水煎液對小白鼠棉球肉芽腫的影響結(jié)果見表5。

由表3 可見，艾草對乙酸致小白鼠毛細(xì)血管通透性升高有一定抑制作用, 高、中、低濃度和陽性對照組對毛細(xì)血管通透性升高抑制率分別為29.11%、27.14%、16.61%和50.89%。艾草水煎液高、中濃度和陽性對照組與空白對照組相比，存在極顯著性差異(P<0.01)；艾草水煎液低濃度組與空白對照組相比存在顯著性差異 (P<0.05) 。不同藥液濃度比,艾草水煎液高濃度組和中濃度組間差異不顯著，高濃度組與陽性對照組存在極顯著性差異(P<0.01)；艾草水煎液中濃度組與低濃度組間存在顯著性差異(P<0.05)，與陽性對照組之間也存在極顯著性差異(P<0.01)；艾草水煎液低濃度組與陽性對照組間存在極顯著性差異(P<0.01) ，與高濃度組和中濃度組相比存在顯著性差異(P<0.05) 。

表3 艾草對小白鼠毛細(xì)血管通透性的影響Table 3 Effect of Artemisia Argyi on capillary permeability of abdominal cavity in mice

表4 結(jié)果顯示，艾草水煎液對二甲苯所致小白鼠耳腫脹有一定的抑制作用, 高、中、低濃度和陽性對照組耳腫脹抑制率分別為25.045%、21.779%、5.082%和31.760%。艾草水煎液高、中濃度和陽性對照組與空白對照組相比存在極顯著性差異（P<0.01），艾草水煎液低濃度組與空白對照組相比存在顯著性差異（P<0.05）；不同藥液濃度比，艾草水煎液高濃度組和中濃度組間差異不顯著，陽性對照組與高濃度組和中濃度組間存在極顯著性差異（P<0.01）；艾草水煎液低濃度組與高、中濃度組和陽性對照組相比存在極顯著性差異（P<0.01）。

表4 艾草對小白鼠耳腫脹的影響Table 4 Effect of Artemisia Argyi on ear swelling in mice

由表5 可見，艾草水煎液對小白鼠棉球肉芽腫增生有一定的抑制作用，高、中和低濃度組小白鼠肉芽腫增生抑制率分別為19.990%、9.101%和2.611%，阿司匹林對小白鼠棉球肉芽腫增生有明顯的抑制作用，小白鼠棉球肉芽腫增生抑制率為49.332%。艾草水煎液高、中濃度和陽性對照組與空白對照組相比存在極顯著性差異（P<0.01）；艾草水煎液低濃度組與空白對照組相比也存在顯著性差異（P<0.05）。不同藥液濃度比, 艾草水煎液高、中濃度組、陽性對照組相比存在極顯著性差異（P<0.01）；艾草水煎液低濃度組與高濃度組和陽性對照組相比較存在極顯著性差異（P<0.01）；與中濃度組相比也存在顯著性差異（P<0.05）。

表5 艾草對小白鼠棉球肉芽腫的影響Table 5 Effect of Artemisia Argyi on granuloma of cotton ball in mice

3 討論

以分離鑒定的致灰鶴腹瀉大腸桿菌為對象，用試管二倍稀釋法和牛津杯法檢測艾草水煎液對大腸桿菌的MIC、MBC 和抑菌活性。結(jié)果表明, 艾草水煎液對引起灰鶴腹瀉的大腸桿菌有一定的抑制生長作用，且抗炎效果隨著藥物濃度的增加而增加。艾草水煎液對大腸桿菌的MIC 和MBC 分別為0.125、0.25、1.0 g/L艾草水煎液抑菌圈直徑為16.622 mm，高度敏感；0.5 g/mL 艾草水煎液抑菌圈直徑為11.841、中度敏感；0.25 g/mL 艾草水煎液抑菌圈直徑為9.420 mm，0.125 g/mL 艾草水煎液無抑菌圈，低敏感或無效。

通過乙酸致小白鼠毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)、二甲苯致小白鼠耳腫脹試驗(yàn)和小白鼠棉球肉芽腫增生試驗(yàn)來測定艾草抗炎作用，分別測定通透性抑制率、小白鼠耳腫脹抑制率和棉球肉芽腫增生抑制率，評價(jià)艾草的抗炎效果。結(jié)果表明，艾草對三種驗(yàn)證模型均有抑制作用，且抗炎作用隨著艾草水煎液濃度的增大而增強(qiáng)。艾草水煎液高濃度組（2 g/kg）毛細(xì)血管通透性抑制率為29.107%，小白鼠耳腫脹抑制率25.045%，小白鼠棉球肉芽腫增生抑制率為19.990%，與空白對照組和陽性對照組相比存在極顯著性差異（P<0.01），表明艾草有一定的抗炎作用，但抗炎效果不如阿司匹林。

中國為抗生素生產(chǎn)和使用大國[8]，當(dāng)前抗生素殘留和致病菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，其中畜禽養(yǎng)殖是環(huán)境中抗生素殘留的主要來源[9-10]，嚴(yán)重危害人類健康和養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展；2020 年1 月1 日，我國實(shí)施“退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種”的最嚴(yán)“禁抗、限抗、無抗”政策[11]。因此，尋找一種無副作用、無毒、無殘留且高效的中草藥成為當(dāng)前熱門研究。本研究以天然中草藥艾草為研究對象，初步探討其抑菌抗炎作用，以期為畜牧養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、促進(jìn)動物綠色健康生產(chǎn)、解決因抗生素殘留而導(dǎo)致的動物產(chǎn)品安全問題提供理論依據(jù)。