HPLC法測定動物源食品中6種抗生素殘留

朱 虹

（河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊 050026）

動物源食品中的抗生素殘留主要是由于動物在飼養(yǎng)過程中不可避免地使用抗生素而造成的，人們?nèi)糸L期攝入抗生素殘留的食物，會導(dǎo)致抗生素在體內(nèi)積蓄，使人們產(chǎn)生毒性和抗藥性等一系列健康問題[1-2]。因此，建立快速、簡單、低成本的動物源食品中抗生素殘留的檢測方法具有重要意義。

目前，抗生素同時檢測使用比較多的方法是液質(zhì)聯(lián)用法[3-4]，但此方法對儀器設(shè)備要求高，價格昂貴，難以達到普及的程度。高效液相色譜儀（HPLC）普及率較高，具有分析檢測速度快、靈敏度高等優(yōu)點。因此，本文建立了HPLC法測定動物源食品中阿莫西林、土霉素、四環(huán)素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素6種抗生素殘留的新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本島津）；ZD-2 pH計（上海雷磁）；ATY124電子天平（日本島津）；KS-3200E超聲波清洗器（昆山市潔力美超聲儀器有限公司）；800B離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XH-B旋渦混合器（天翎儀器）；HN200氮吹儀（海能儀器）。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：甲砜霉素購自上海阿拉丁公司；阿莫西林和氟苯尼考購自上海吉至生化科技有限公司；土霉素、四環(huán)素和氯霉素購自上海源葉生物科技公司；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；甲酸、EDTA、正己烷等試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

分別稱取一定量的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈-水（4∶1，V/V）溶解，制備成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-20 ℃避光密封保存。

1.3.2 樣品前處理

稱取1.5 g剁碎并勻質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水-0.1 mol/L EDTA溶液（15∶4∶1，V/V/V），渦旋振蕩3 min，4 000 r/min 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL離心管中，加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋振蕩5 min，靜置3 min，棄去正己烷層，將提取液轉(zhuǎn)移至氮吹儀用管中進行氮吹濃縮，再用流動相初始比例復(fù)溶，0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.3.3 色譜條件

色 譜 柱：Agilent ZORBAX SB-C18,5 μm，4.6 mm×250 mm；流動相：乙腈-甲酸溶液（pH2.50）在0～3 min內(nèi)為18∶82（V/V），在3～15 min內(nèi)變?yōu)?3∶67（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種抗生素分離色譜圖

采用液相色譜儀（二極管檢測器）檢測6種抗生素，結(jié)果表明，12 min內(nèi)其可對6種抗生素進行分離檢測，且分離效果良好。6種抗生素分離色譜圖，如圖1所示。

圖1 6種抗生素分離色譜圖

2.2 樣品前處理

在動物源性食品中抗生素殘留檢測中，乙腈是應(yīng)用最多的提取劑[5]，乙腈-水體系對各類型的獸用抗生素都有較好的溶解能力且具有沉淀蛋白的作用。另外，EDTA可防止四環(huán)素、土霉素與樣品中的重金屬發(fā)生絡(luò)合，所以在乙腈-水體系中加入了EDTA溶液。當(dāng)乙腈-水-0.1 mol/L EDTA溶液為15∶4∶1（V/V/V）時，提取效果最佳，雜質(zhì)干擾較小，回收率較高。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

選取了甲醇體系和乙腈體系作為流動相，研究發(fā)現(xiàn)，甲醇體系分離效果不好，且運行時間較長，而乙腈-甲酸體系經(jīng)過優(yōu)化能在比較短的時間內(nèi)將6種抗生素進行分離，最終選取乙腈-甲酸體系作為流動相。

2.4 甲酸溶液pH值的選擇

本文選取pH值為2.0、2.5、 3.0、3.5和4.0的甲酸溶液進行試驗，試驗結(jié)果表明，當(dāng)甲酸溶液的pH為2.5時，6種抗生素的分離效果最佳。

2.5 不同柱溫對樣品峰型的影響

本文考察了25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃這4種柱溫對6種抗生素分離的影響，結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，色譜峰的出峰時間整體縮短，但土霉素和四環(huán)素分離效果變差。當(dāng)柱溫為30 ℃時，6種抗生素整體分離效果較好，出峰時間適合且峰形較好。

2.6 回歸分析及檢出限

量取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按照1.3.3的流動相初始比例分別將其稀釋成25 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，利用HPLC由低濃度到高濃度依次進行測定，每個濃度重復(fù)測定3次，以平均峰面積值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比（S/N）所對應(yīng)的濃度為檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N）所對應(yīng)的濃度為定量限（LOD），結(jié)果見表1。由表1可知，6種抗生素在25～100 μg/kg，6種抗生素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為8～9 μg/kg，定量限為 27 ～ 30 μg/kg。

表1 6種抗生素線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.7 加標(biāo)回收率

稱取1 g空白樣品，添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，制成40 μg/kg的空白添加樣品，按照1.3.2法處理后，進行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，樣品的加標(biāo)回收率為84.8%～91.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～4.3%。表明方法穩(wěn)定且重現(xiàn)性好。

表2 加標(biāo)回收率結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過對肉源性食品中阿莫西林、土霉素、四環(huán)素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素6種抗生素的提取優(yōu)化和檢測方法的優(yōu)化，實現(xiàn)了12 min內(nèi)梯度分離6種抗生素，且該方法操作簡單，快速高效，可為肉源性食品中多抗生素殘留的檢測提供參考依據(jù)。