九香蟲三氯甲烷浸提物對兩種癌細胞增殖和周期的影響

侯曉暉，孫廷，李曉飛

(遵義醫(yī)學院，貴州遵義563000)

九香蟲Aspongopus chinensisDallas，隸屬于半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae，俗稱黑兜蟲、打屁蟲、屁板蟲、屁巴蟲等，分布于我國云南、貴州、四川等省，為我國特有種［1］，是一種重要的中藥昆蟲?！侗静菥V目》早有記載:“咸，溫，無毒，用于膈脘滯氣、脾腎虧損、壯腎之陽”［2］。近年有報道稱，九香蟲是一種抗癌昆蟲，主治食管癌、胃癌［3-4］，但缺乏藥理實驗數(shù)據(jù)的支持。

本研究通過三氯甲烷冷浸法提取九香蟲體內(nèi)的有效成分進行體外抗人胃癌SGC-7901和肝癌HepG2細胞的實驗，并初步推測抗癌活性成分在九香蟲體內(nèi)的存在形式，從而為其藥用價值的深入開發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料和儀器

1.1 九香蟲標本采自貴州省遵義市習水縣土城鎮(zhèn)赤水河邊，將標本置于烘箱中干燥后保存?zhèn)溆?，實驗前將其研磨成粉末?/p>

1.2 細胞株胃腺癌細胞株SGC-7901和肝癌細胞株HepG2，均由遵義醫(yī)學院中心實驗室提供。

1.3 試劑RPMI 1640培養(yǎng)液(GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青公司)、細胞周期與凋亡試劑盒(杭州碧云天生物技術有限公司)、胰酶(Solarbio)、二甲基亞楓(DMSO，Solarbio)、四甲基偶氮唑鹽(MTT，Solarbio)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器設備超凈工作臺(北京半導體設備一廠);CO2培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司);倒置顯微鏡(南京江南永新光學有限公司);臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械有限公司);臺式冷凍恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠)。

2 方法

2.1 三氯甲烷浸提物制備取九香蟲粉末10 g，用60 mL三氯甲烷浸泡12 d，過濾、自然揮干，得到九香蟲的粗提物浸膏。取此浸膏0.5 g，溶于0.5 mL的三氯甲烷中，充分溶解后過濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)與傳代將SGC-7901和HepG2細胞置于37℃、飽和相對濕度5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清及1%抗生素(青霉素100 mg/L和鏈霉素100 mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基。細胞呈單層生長并鋪滿瓶底時，采用0.25%的胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.3 MTT試驗取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度至1×106/mL，將其接種于96孔板中待用［5］。實驗設置給藥組、空白對照組和陰性對照組，其中空白對照組為僅加入培養(yǎng)基，陰性對照組為加入含三氯甲烷的培養(yǎng)基，而給藥組為加入九香蟲三氯甲烷浸提物，設置6個不同濃度，并設6個重復(見表1)。按照實驗需要加入100 μL含/不含藥培養(yǎng)基。將細胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min。酶標儀檢測吸光度(OD)值，并用下式計算腫瘤細胞生長抑制率及其IC［6］50，實驗重復3次:

腫瘤細胞生長抑制率(%)=［1－D(K)給藥組/D(K)對照組］×100%

IC50=Ig－1［Xm－I(∑p－0.5)］［D(K)代表OD值，K是變量，Xm為最大劑量對數(shù)值，P為細胞抑制率，∑p各組細胞抑制總和，I為相鄰兩組劑量比值的對數(shù)］。

2.4 顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化將對數(shù)生長期的SGC-7901和HepG2細胞用胰酶消化，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，接種于放置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細胞爬片生長。培養(yǎng)24 h，待細胞在蓋玻片上貼壁良好后，加入三氯甲烷浸提物處理細胞，觀察細胞形態(tài)變化

2.5 流式細胞儀檢測細胞周期收集給藥組(2 000 μg/mL和1 000 μg/mL)和空白對照組細胞于離心管中，離心收集細胞;PBS洗滌，加入70%乙醇，置于4℃冰箱中固定36 h以上。收集細胞，PBS再次洗滌;避光條件下加入200 μL染色液(含RNase A的碘化丙啶染色液PI)，輕輕吹打均勻，溫熱30 min后，4℃放置備用。流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡，結果用CELLQuest軟件分析。

2.6 統(tǒng)計分析利用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差即(±s)表示。

3 結果

3.1 顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化九香蟲三氯甲烷浸提物(500 μg/mL)處理SGC-7901和HepG2細胞24 h后，與空白對照組相比細胞數(shù)目明顯減少。鏡下可見空白對照組的細胞成群貼壁生長，細胞透亮、胞膜清晰、折光性好;而給藥組貼壁細胞數(shù)量減少，細胞變圓，皺縮，與鄰近細胞之間空隙加大，形成較多的細胞碎片(見圖1)。

圖1 九香蟲三氯甲烷浸提物對SGC7901細胞形態(tài)的影響Fig.1 Effects of the crude extracts on the morphous of SGC7901 cells

3.2 三氯甲烷浸提物對SGC-7901和HepG2細胞增殖的影響MTT實驗結果顯示，三氯甲烷浸提物對SGC-7901和HepG2細胞具有明顯的體外增殖抑制作用，并呈劑量依賴性(見表1、圖2)。由上述IC50計算公式可知，三氯甲烷浸提物對兩種癌細胞的IC50分別為1 193.52 μg/mL和964.34 μg/mL。

表1 九香蟲三氯甲烷浸提物對SGC-7901和HepG2細胞增殖的抑制作用(±s，n=6)Tab.1 Effects of crude extracts on the proliferation of SGC-7901 and HepG2 cells(±s，n=6)

表1 九香蟲三氯甲烷浸提物對SGC-7901和HepG2細胞增殖的抑制作用(±s，n=6)Tab.1 Effects of crude extracts on the proliferation of SGC-7901 and HepG2 cells(±s，n=6)

三氯甲烷浸提物/(μg·mL－1)SGC-7901抑制率/%HepG2抑制率/%125 14.13±0.033 4 18.89±0.018 4 250 29.93±0.025 5 54.05±0.026 8 500 33.94±0.038 7 62.89±0.012 7 1 000 38.78±0.010 6 71.20±0.029 5 2 000 45.49±0.038 0 75.04±0.026 9 4 000 91.57±0.007 2 78.33±0.021 2

圖2 九香蟲三氯甲烷浸提物對SGC-7901和HepG2細胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of crude extracts on the proliferation of SGC-7901 and HepG2 cells

3.3 三氯甲烷浸提物對SGC-7901和HepG2細胞周期的影響流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示，三氯甲烷浸提物的中劑量組(2 000 μg/mL)和高劑量組(4 000 μg/mL)處理細胞24 h后與對照組相比，HepG2細胞周期中各時相細胞數(shù)發(fā)生顯著變化，而SGC-7901細胞周期的分布變化規(guī)律不明顯(見圖3、表2)。

HepG2細胞對照組G0/G1期、S期和G2/M期細胞比例分別為57.66%、34.71%和7.63%;而中劑量組細胞比例分別為69.65%、24.92%和5.43%，高劑量組細胞比例分別為76.99%、16.91%和6.10%。由實驗結果可知，給藥組的S期細胞比例明顯降低、G2/M期細胞變化不大，而G0/G1期細胞比例明顯升高，與對照組相比差異具有顯著性(P＜0.05)。

4 討論

近年來，惡性腫瘤已逐步上升為第一大殺手，而胃癌和肝癌是我國常見的惡性腫瘤，臨床主要以手術治療合并術后放療和化療為主要治療手段，但對晚期效果不佳。臨床上不斷探索新的抗癌藥物的開發(fā)與應用，而九香蟲作為我國特有的中藥昆蟲，

圖3 九香蟲三氯甲烷浸提物對HepG2細胞周期的影響Fig.3 Effect of the crude extracts on cell cycle of HepG2

表2 HepG2和SGC7901細胞周期各時相分布結果Tab.2 Results of DNA analysis on HepG2 and SGC7901 cells

有報道稱其對食管癌、胃癌等有一定療效［3］。本實驗結果顯示，九香蟲三氯甲烷浸提物通過對細胞周期的影響，可抑制人胃癌SGC-7901細胞和肝癌HepG2細胞生長，且這一變化呈現(xiàn)劑量依賴性。盡管本研究中IC50較大，但究其原因應為本實驗中使用的是九香蟲的三氯甲烷浸提物而非純品［7-8］。

腫瘤發(fā)生的基礎是細胞生長和凋亡失調(diào)，由于細胞紊亂，從而導致腫瘤的發(fā)生。細胞周期機制的破壞是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)之一，細胞一旦從G1期跨入S期，則可以不再依賴外界信息刺激而很快自動完成分裂過程［9］。本實驗結果顯示，HepG2細胞在藥物作用后呈現(xiàn)G0/G1期的阻滯現(xiàn)象，這可能阻斷了細胞生長、分裂，從而延長了細胞周期，這與植酸等阻滯HepG2細胞于G1期從而抑制細胞增殖相類似［10-11］。但是，其確切的分子機制將有待于進一步深入研究和探討。

九香蟲的三氯甲烷浸提物對兩種癌細胞具有一定的抑制作用，由于三氯甲烷可提取九香蟲體內(nèi)的非極性成分(即脂類物質(zhì))，故可初步推斷其抗腫瘤活性成分為此類物質(zhì)，但由于此三氯甲烷浸提物成分復雜且純度較低，故尚不能確定其為何種物質(zhì)(即單一純品)［12］。

迄今為止，人們對九香蟲藥用機理的研究少之又少，本實驗正是根據(jù)傳統(tǒng)中藥藥用價值的研究方法而展開研究，希望能為這一重要的中藥昆蟲——九香蟲在臨床防治腫瘤方面的應用提供理論基礎。

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