富血小板血漿和濃縮生長因子對人牙周膜細胞增殖和成骨分化影響的研究

劉娟 陳斌 閆福華

南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院·南京市口腔醫(yī)院牙周病科 南京 210008

牙周炎是由菌斑生物膜引起的慢性感染性疾病，會導致牙周組織炎癥感染甚至喪失，是成年人失牙的主要原因之一。同時，牙周炎的疾病發(fā)展與全身健康密切相關(guān)。牙周治療的最終目標是修復和重建已破壞的牙周組織，實現(xiàn)牙周組織再生[1]。目前的牙周治療可以有效控制牙周炎癥，尚不能獲得理想的組織再生，因此，尋找有效的促進牙周組織再生的方法具有重要的臨床意義。

牙周膜細胞（periodontal ligament cells，PDLCs）是牙周組織的主要構(gòu)成細胞，是一個異質(zhì)性很強的細胞群，其中包含的牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）具有自我更新和多向分化的潛能[2]，可以分化為成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞和成纖維細胞等，在維持牙周組織穩(wěn)態(tài)和促進牙周組織修復再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

血小板濃縮制品是近年來臨床上比較常用的自體來源性生長因子，包含多種生長因子且質(zhì)量濃度較高，各種生長因子的比例與人體中生長因子的比例相符，生物安全性高且外源性感染風險低。目前常用的血小板濃縮制品主要包括富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）和濃縮生長因子（concentrate growth factor，CGF）。PRP是自體全血經(jīng)二次離心得到的血小板濃縮物，其血小板質(zhì)量濃度至少為全血血小板的4倍以上[3-4]；CGF是全血通過加速離心制取的新一代血小板濃縮制品，呈凝膠狀，富含生長因子的同時兼具了纖維團塊的立體構(gòu)架，可以壓制成膜狀，有利于手術(shù)創(chuàng)面的初期穩(wěn)定[5]。

張宇等[6]使用PRP聯(lián)合磷酸三鈣修復種植體周骨缺損，對術(shù)后骨組織標本進行組織學觀察發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，PRP組新骨形成更為致密。Choi等[7]的研究則表明：低質(zhì)量濃度的PRP可促進牙槽骨相關(guān)細胞的增殖，而高質(zhì)量濃度的PRP反而會抑制細胞的增殖。Bozkurt Do?an等[8]通過膜齦手術(shù)的臨床對照試驗發(fā)現(xiàn)：加入CGF的實驗組，其角化齦寬度和厚度的增量均高出對照組約0.4 mm，且術(shù)后牙齦退縮的風險更低。Pirpir等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)：CGF可以促進成骨細胞的增殖能力，亦可促進細胞的分化速度，促進骨修復過程；然而Honda等[10]則認為：高質(zhì)量濃度CGF會抑制干細胞的增殖和分化。魏中武等[11]通過對比大量文獻發(fā)現(xiàn)：CGF雖然在口腔臨床的應用廣泛，但作用機制有待研究。

鑒于PDLCs在牙周穩(wěn)態(tài)和牙周組織修復再生過程中的作用，筆者有理由提出設(shè)想：PRP和CGF對PDLCs的增殖和分化存在影響，從而影響著牙周組織修復再生的過程，因此有必要對PRP、CGF在牙周組織修復再生過程中發(fā)揮的作用進行探討，以期指導其在臨床上的有效應用。本文通過研究 PRR、CGF 對人PDLCs （human PDLCs，hPDLCs）增殖、遷移及成骨分化的影響，進一步探討PRP、CGF在牙周組織再生中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國），抗波形絲蛋白抗體、抗角蛋白抗體（Bioworld 公司，美國），茜素紅、油紅O、CCK-8（Cell Counting Kits-8） 試劑盒 （Sigma公司，美國），結(jié)晶紫染液（南京凱基生物公司），Runx2（runt-related transcription factor 2）（Cell Signaling Technology，美國），Dlx5（distal-less homebox 5）抗體、Msx2 （mu-scle segment homeobox gene 2）抗體（Abcam公司，英國）和Osx（Osterix）抗體（R&D公司，美國）等。

一次性真空采血管、細胞培養(yǎng)皿（Corning公司，美國）、倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）、CGF離心機（Medifuge公司，意大利）。

1.2 hPDLCs的培養(yǎng)與鑒定

收集18~30歲志愿者拔除的健康的正畸減數(shù)牙或阻生牙，反復沖洗后刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，采用組織塊法進行原代培養(yǎng)。選取生長良好的第2代hPDLCs行波形絲蛋白、角蛋白染色，通過免疫組織化學法檢測細胞來源，CCK-8法檢測細胞增殖能力，油紅O和茜素紅染色分別檢測細胞成脂分化和成骨分化的潛能。本實驗經(jīng)南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準（批準號為ChiCTR-OCH-13004679），所有志愿者均已知情同意。

1.3 血小板濃縮制品的制備與血小板計數(shù)

選取7名健康志愿者制備血小板濃縮制品。7名志愿者年齡22~26歲，無全身系統(tǒng)性疾病，女性處于非經(jīng)期和孕期。實驗經(jīng)南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準（批準號為ChiCTROCH-13004679），所有志愿者均已知情同意。

抽取志愿者肘靜脈全血25 mL，分為3組。1）對照組：5 mL全血加入抗凝劑；2）PRP組：10 mL全血加入抗凝劑，制備PRP；3）CGF組：10 mL全血不加抗凝劑，制備CGF。

1.3.1 PRP 制備 肘靜脈全血10 mL（加入抗凝劑），1 000 r·min-1離心15 min，吸取上層血漿（包括血小板和白細胞層）及下方1 mm以內(nèi)的紅細胞層，3 000 r·min-1離心8 min，上層的貧血小板血漿棄去，將底層的血小板、少量的紅細胞和白細胞混合物充分懸浮置于EP管中，即為PRP。對PRP進行血小板計數(shù)。將含有100 U·mL-1人凝血酶的10% CaCl2混合液按1∶9的體積比加入PRP中，4 ℃過夜；待血塊充分收縮后，4 000 r·min-1重離心20 min；吸取上清液置于EP管中，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CGF 制備 肘靜脈全血10 mL（不加入抗凝劑），按照CGF制備程序（加速30 s，2 700 r·min-1離心2 min，2 400 r·min-1離心4 min，2 700 r·min-1離心4 min，3 000 r·min-1離心3 min，減速36 s至停止）離心，分為3層：上層為貧血小板血漿層，下層為紅細胞層，中間即為CGF凝膠層（圖1）。取CGF層及部分與紅細胞層交界的沉淀物置于離心管中，室溫下靜置60 min，3 000 r·min-1離心20 min，取上清部分即為實驗用CGF。對制備的CGF進行血小板計數(shù)，分裝，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 全血制備CGFFig 1 The preparation of CGF from the whole blood

1.4 CCK-8 法 檢 測 PRP、CGF 對 hPDLCs 增 殖 能力的影響

選取生長良好的第3、4代hPDLCs細胞，以每毫升1×105個細胞的密度接種于96孔板，每孔接種100 μL，根據(jù)添加培養(yǎng)基不同分為3組。1）對照組：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2）PRP組：含質(zhì)量分數(shù)5%PRP的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；3）CGF組：含質(zhì)量分數(shù)5% CGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。3組細胞置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液；每天隨機選取8個檢測孔，每檢測孔加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；采用酶聯(lián)免疫檢測儀測量450 nm波長下各組的吸光度值。

1.5 細胞劃痕實驗檢測PRP、CGF對hPDLCs遷移能力的影響

選取生長良好的第3~4代hPDLCs細胞，以每毫升1×105個細胞的密度接種于6 cm細胞培養(yǎng)皿，每皿接種3 mL，根據(jù)添加培養(yǎng)基不同分為3組。1）對照組：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2）PRP組：含質(zhì)量分數(shù)5% PRP的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；3）CGF組：含質(zhì)量分數(shù)5% CGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。3組細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，使用無菌細胞刮在培養(yǎng)皿底壁輕刮、旋轉(zhuǎn)，制造直徑約8 mm的圓形損傷區(qū)域，光學顯微鏡下檢查損傷模型區(qū)域無細胞殘留，分別在培養(yǎng)第1、4、7、10、13天每組選取1個培養(yǎng)皿進行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察hPDLCs的遷移能力。

1.6 PRP、CGF對hPDLCs成骨分化影響的研究

選取第3~4代hPDLCs細胞，以每毫升1×105個細胞的密度接種；24 h細胞貼壁后，用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞同步化，將細胞分為3組。1）對照組：用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；2）PRP組：分別用含有質(zhì)量分數(shù)1%、5%、10%PRP的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；3）CGF組：分別用含有質(zhì)量分數(shù)1%、5%、10% CGF的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。以上各組細胞分別培養(yǎng)24、48、72 h，進行礦化誘導，提取各組hPDLCs細胞總蛋白，Western blot檢測hPDLCs成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx、Dlx5和Msx2的表達情況，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行處理，組間差異比較采用單因素方差分析，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hPDLCs的分離培養(yǎng)及鑒定

采用組織塊法培養(yǎng)細胞在第4~5天可在顯微鏡下看見細胞從組織塊周圍游出，呈放射狀生長。細胞呈長梭形，漩渦狀排列；抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性。CCK-8法檢測顯示細胞具備增殖能力，生長曲線基本呈S形；經(jīng)礦化誘導，可見礦化結(jié)節(jié)形成，經(jīng)成脂誘導，可見脂滴形成（圖2）。

圖2 hPDLCs的分離培養(yǎng)及鑒定Fig 2 The isolation culture and identification of hPDLCs

2.2 血小板計數(shù)

PRP中的血小板計數(shù)均為全血血小板數(shù)量的5倍以上，達到PRP的制備標準（表1）。全血制備出的CGF樣本中，通過血小板檢測儀未檢測出血小板存在（表1）。

表1 全血、PRP和CGF的血小板計數(shù)Tab 1 The platelet count of whole blood,PRP and CGF

2.3 PRP和CGF對hPDLCs增殖能力的影響

3組的增殖曲線見圖3：與對照組相比，5%PRP和5% CGF組hPDLCs的增殖明顯增強，細胞生長曲線基本呈S形；在快速增殖期（4~6 d），對照組與2個實驗組的差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示PRP、CGF均可促進hPDLCs的增殖。

圖3 PRP、CGF對hPDLCs增殖能力的影響Fig 3 The effect of PRP and CGF on the proliferation ability of hPDLCs

2.4 PRP和CGF對hPDLCs遷移能力的影響

3組的細胞劃痕實驗結(jié)果見圖4：與對照組相比，PRP和CGF組的細胞遷移能力增強；第13天，PRP、CGF組無細胞區(qū)域有70%~80%的面積鋪滿細胞，而對照組無細胞區(qū)域僅約50%鋪滿細胞。與對照組相比，PRP、CGF組對hPDLCs遷移能力的影響具有明顯差異（P<0.05）；而CGF與PRP組相比，兩組無明顯差異（P>0.05）。結(jié)果提示：PRP和CGF均可促進hPDLCs的遷移，但二者促進細胞遷移的作用無明顯差異。

圖4 PRP、CGF對hPDLCs遷移能力的影響 結(jié)晶紫染色Fig 4 The effect of PRP and CGF on the migration ability of hPDLCs crystal violet staining

2.5 PRP、CGF對hPDLCs成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達水平的影響

Western blot檢測結(jié)果見圖5、6。與對照組相比，PRP、CGF組Runx2、Osx、Dlx5的表達升高，Msx2表達降低；在PRP、CGF質(zhì)量分數(shù)為10%時，與對照組的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與PRP組相比，10%CGF組Runx2的表達升高，Dlx5在培養(yǎng)24、48 h時的表達升高，10%CGF組Msx2的表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖5 Western blot 法檢測PRP、CGF對成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Msx2、Osx、Dlx5、Runx2表達的影響Fig 5 The effect of PRP and CGF on the expression of Msx2,Osx,Dlx5 and Runx2 detected with Western blot

3 討論

PRP、CGF作為血小板濃縮制品，在血小板被激活后，可釋放多種生物活性物質(zhì)，包括多種生長因子，如血小板源性生長因子（platelet-derived growth factors，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）等，可以促進成纖維細胞和成骨細胞的增殖和分化、血管生成，促進傷口愈合[12]。PRP具有促進骨重建、減輕術(shù)后反應、抗感染及炎癥調(diào)節(jié)等作用[13]。CGF作為第3代血小板濃縮制品，也具有促進細胞增殖、成骨分化和促進血管生成等作用[14]。

本研究血小板計數(shù)結(jié)果顯示：PRP中血小板計數(shù)量約為全血的5倍，符合PRP的制備標準[15]。CGF在制備過程中，未加入外源性抗凝劑，在變速離心、室溫靜置、再離心等過程中，血小板被激活，血小板計數(shù)未檢測出。另外，值得注意的是，不同志愿者的全血制備出的血液制品中血小板計數(shù)存在差異，提示血小板計數(shù)存在個體差異性。

本研究通過組織塊法獲得hPDLCs，多數(shù)細胞的胞體較大，呈長梭形（圖2），提示分離的細胞主要由成纖維樣細胞和不同分化階段的細胞共同組成，是含有干細胞成分的細胞群；經(jīng)免疫組織化學鑒定為間質(zhì)細胞來源，與既往的研究[16]相符。本實驗采用第3~4代hPDLCs，具備較好的增殖能力，在培養(yǎng)4~6 d增殖明顯，之后增殖能力逐漸趨于平穩(wěn)。對hPDLCs進行多向誘導，脂滴和礦化結(jié)節(jié)的形成證明細胞具備成脂、成骨分化的能力，說明本實驗獲得的是一群異質(zhì)性，具有增殖、多向分化潛能的hPDLCs[17]。

圖6 PRP、CGF對成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Dlx5、Osx、Msx2表達的影響Fig 6 The effect of PRP and CGF on the expression levels of Runx2,Dlx5,Osx and Msx2

本實驗中CCK-8實驗（圖3）結(jié)果顯示：PRP、CGF均可促進hPDLCs的增殖，促進效果明顯優(yōu)于對照組，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），CGF組促進hPDLCs增殖水平最高。細胞劃痕實驗（圖4）結(jié)果顯示：PRP和CGF均能夠促進hPDLCs的細胞遷移，且CGF的促進效果優(yōu)于PRP。其可能原因是：PRP和CGF作為血小板濃縮制品，富含多種生長因子，包括TGF-β、VEGF、PDGF等，可促進細胞的增殖和遷移；CGF通過加速離心方式，最大限度地富集了血小板中的生長因子，可能具有更優(yōu)的促進作用。

Runx2、Osx、Dlx5和Msx2等成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子通過參與轉(zhuǎn)化生長因子-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein）信號通路、Notch信號通路及Wnt信號通路等參與調(diào)節(jié)骨代謝過程，對骨代謝及骨重塑具有重要意義[18]。Runx2 的表達提示成骨細胞 （osteoblast，OB）開始分化，可以激活相關(guān)成骨蛋白（骨鈣蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等）的轉(zhuǎn)錄和表達，促進成骨細胞向分化[19]。Osx處于OB分化路徑中Runx2的下游，受Runx2表達的影響[20]。Dlx5能夠調(diào)節(jié)BMP-2誘導Runx2、Osx的表達過程[21]，Msx2能抑制Runx2的轉(zhuǎn)錄活性；Msx2與Dlx5相互協(xié)調(diào)，Dlx5可干擾Msx2對Runx2的抑制作用。

本實驗以不同質(zhì)量分數(shù)（1%、5%、10%）的PRP、CGF分別與hPDLCs共培養(yǎng)不同的時間（24、48、72 h），Western blot結(jié)果（圖5）顯示：隨著培養(yǎng)時間的增加，Runx2、Osx、Dlx5的蛋白表達量增加，且呈時間依賴性，在72 h達到最高；在同樣時間下，隨著PRP、CGF質(zhì)量分數(shù)的增加，蛋白表達量增加，在10%時達到最高；而Msx2蛋白表達量在24 h時相對最高，隨著PRP、CGF質(zhì)量分數(shù)的增加，其表達量降低。這與以往的研究[22-24]基本相符。本實驗中，與PRP相比，CGF對Runx2、Dlx5的促進作用在質(zhì)量分數(shù)為10%時存在明顯差異，而對Osx的促進作用在不同質(zhì)量分數(shù)之間則沒有明顯差異；CGF對Msx2的抑制作用較弱，僅在質(zhì)量分數(shù)為10%時與其他質(zhì)量分數(shù)存在差異。此外，本研究發(fā)現(xiàn)：hPDLCs成骨分化過程中，Runx2、Osx、Dlx5和Msx2的表達受PRP和CGF的影響，提示PRP、CGF對hPDLCs成骨分化具有促進作用，其過程是多重轉(zhuǎn)錄因子和信號通路共同調(diào)控的結(jié)果。后續(xù)的研究中需要進一步明確發(fā)揮主要作用的轉(zhuǎn)錄因子，必要時進行進一步的靶向抑制劑的調(diào)控研究。

有研究[7,10]發(fā)現(xiàn)：低濃度、高濃度的PRP和CGF對細胞的增殖、分化能力影響不同。筆者在前期的預實驗中，采用的是5%和8%的RPR和CGF觀察其對hPDLCs增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RPR和CGF均可促進hPDLCs的增殖能力，但是兩者間無明顯差異。同時，由于從全血中制備PRP和CGF的量不多，因此，在本研究采用1%、5%、10%的PRP、CGF與hPDLCs共培養(yǎng)，結(jié)果顯示均具備促進增殖、遷移和分化的能力。但是，本實驗中PRP、CGF對hPDLCs的促進作用未能達到并形成一個峰值進而出現(xiàn)拐點，因此后續(xù)研究中需要進一步提高PRP、CGF的質(zhì)量分數(shù)，研究其對hPDLCs的作用，進一步探討臨床應用的最適宜質(zhì)量分數(shù)。

綜上所述：PRP、CGF可以促進hPDLCs增殖，增強Runx2、Osx、Dlx5表達并抑制Msx2表達，達到促進hPDLCs成骨分化的作用。PRP和CGF有望在牙周組織重建中發(fā)揮重要作用，但其作用機制、最適宜的作用質(zhì)量分數(shù)及臨床療效尚需要進行進一步的臨床研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。