攀西礦區(qū)典型重金屬污染土壤化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)探索

鄧敏,程蓉,舒榮波,徐璐,李超,代力

（中國地質(zhì)科學(xué)院礦產(chǎn)綜合利用研究所, 礦山生態(tài)調(diào)查修復(fù)室, 四川 成都 610041）

攀西地區(qū)是我國重要的成礦帶，礦產(chǎn)資源豐富，其區(qū)域土壤背景值偏高[1-2]。持續(xù)多年的高強度礦產(chǎn)開采導(dǎo)致部分地區(qū)出現(xiàn)較為嚴重的土壤重金屬污染問題[3-4]。多項調(diào)查研究表明，攀西地區(qū)部分礦產(chǎn)集中開采區(qū)周邊土壤中鉛、鋅、鎘、鉻等重要環(huán)境健康指標(biāo)出現(xiàn)污染情況，對該區(qū)域生態(tài)環(huán)境質(zhì)量、糧食安全、人體健康造成了潛在威脅[5-6]。針對土壤重金屬污染問題，目前一般采用物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)與生物修復(fù)技術(shù)。物理修復(fù)工程浩大，成本較高，難以大規(guī)模應(yīng)用[7]。化學(xué)修復(fù)是一種比較成熟的土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)，其中有機絡(luò)合成本低、見效快，目前主要用于農(nóng)田土壤重金屬絡(luò)合鈍化，但也存在二次污染的問題[8-9]。生物修復(fù)成本低、綠色無污染，是土壤重金屬修復(fù)的重點發(fā)展方向，并且以微生物為核心的多種修復(fù)方法聯(lián)合使用將受到越來越多的重視[10]。

微生物穩(wěn)定，同時輔以化學(xué)絡(luò)合是目前重金屬鈍化的研究熱點[11-12]。適宜的化學(xué)絡(luò)合劑不僅可絡(luò)合穩(wěn)定重金屬，還可以供給微生物生長，在穩(wěn)定土壤重金屬的同時，還解決了化學(xué)修復(fù)的二次污染問題，具有廣闊的應(yīng)用前景[13]。目前主流的絡(luò)合劑有檸檬酸、草酸、丙酸等，主要用于重金屬鈍化材料以及強化植物萃取劑的制備[9]?？捎糜诜€(wěn)定化的微生物也有很多，其中又以硫酸鹽還原菌（(Sulpate-Reducing Bacteria, SRB)為代表，SRB是一類能通過異化作用進行硫酸鹽還原的細菌，其生存、適應(yīng)能力較強，目前SRB已廣泛應(yīng)用于重金屬廢水（電鍍廢水、礦山酸性廢水）以及重金屬沉積物處理[14-15]，但迄今為止，將SRB應(yīng)用于土壤重金屬修復(fù)的研究還鮮有報道。

因此本研究以SRB為修復(fù)微生物，以有機酸類為絡(luò)合劑，開展了SRB篩選及生長特征考察實驗、化學(xué)絡(luò)合實驗和化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)實驗，綜合探索了化學(xué)絡(luò)合-微生物穩(wěn)定聯(lián)合修復(fù)技術(shù)體系應(yīng)用的可能性，希望開發(fā)出具有成本低、效率高、綠色安全等優(yōu)點的化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，為解決攀西地區(qū)土壤重金屬污染問題提供有參考價值的基礎(chǔ)研究。

1 實 驗

1.1 實驗材料

1.1.1 供試土壤

供試土壤采自于攀枝花某地，剔除雜質(zhì)、風(fēng)干，磨細并過尼龍篩，備用。土壤理化性質(zhì)見表1。

表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of soil

1.1.2 實驗試劑

本次研究所用的試劑均為分析純（AR），包括無水硫酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化銨、硫酸亞鐵銨（六水）、氯化鈉、丙酸鈉、酵母膏、丙三醇、丁二酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖、正丁醇、草酸、檸檬酸、蘋果酸、丙酸、丁二酸、乙酸、氯化鎘、氯化鉛等。

1.1.3 供試SRB純菌菌種

本試驗過程中采用的純種細菌為脫硫弧菌脫硫亞種（Desulfovibriodesulfuricans subsp.desulfuricans）由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供，購買編號為1.3469。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物篩選參照杜剛[16]研究，SRB富集培養(yǎng)基配方見表2。

表2 SRB的富集培養(yǎng)基配方(1 L)Table 2 Enrichment medium formulation of SRB

1.2.2 硫酸鹽還原菌對鎘、鉛鈍化還原效果分析

配置SRB液體培養(yǎng)基加入CdCl2/PbCl2，用NaOH調(diào)pH值為7.0，分別將純菌和混合菌接種至液體培養(yǎng)基，然后置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察混合菌對Cd2+、Pb2+的鈍化還原情況，并檢測Cd2+、Pb2+的濃度，分析其去除率。

去除率=(C初-C末)/C初× 100%

式中：C初為溶液中Cd2+/Pb2+初試濃度，mg/L。

C末為鈍化還原后溶液中Cd2+/Pb2+濃度，mg/L。

1.2.3 SRB對化學(xué)絡(luò)合劑的利用效果分析

參照毛在砂[17]的研究，在保證總含碳數(shù)一致的標(biāo)準(zhǔn)下，選取12種碳源：乳酸鈉、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、丙酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、酒石酸鈉、丙三醇、正丁醇、葡萄糖、檸檬酸、蘋果酸。通過測定FeS生成量來分析SRB對不同底物的利用狀況[18]。本次實驗培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境為pH=7.0、T=30 ℃，除碳源外，其他營養(yǎng)物質(zhì)參照表2配置。

1.2.4 化學(xué)絡(luò)合劑對土壤重金屬的絡(luò)合效果分析

選取上述微生物碳源，分別以液固比1:20、1:100、1:200、1:300(其中“液”指化學(xué)絡(luò)合劑，單位mL；“固”指土壤，單位：g，下同)加入土壤[19]。待土壤穩(wěn)定后，分別檢測土壤重金屬鎘、鉛形態(tài)特征變化，重金屬形態(tài)采用Tessier[20]五步萃取法測定，對照為未作處理的土壤，記為CK。

1.2.5 化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤重金屬穩(wěn)定化效果分析

先將絡(luò)合劑以用1:300和1:200的液固比[19]施入土壤中，再將SRB接入土壤，然后置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待土壤穩(wěn)定后，分析鉛、鎘形態(tài)變化以及土壤肥效變化，肥效參數(shù)測定參照《土壤農(nóng)化分析》[21]進行，對照樣與1.2.4使用的保持一致，同樣記為CK。

2 實驗結(jié)果

2.1 硫酸鹽還原菌篩選

在四川某一排污井取污泥樣，進行選擇性培養(yǎng)，獲得一株混合型SRB。該混合菌生長過程中的代謝產(chǎn)物硫化氫(H2S)與培養(yǎng)基中的亞鐵離子（Fe2+）結(jié)合生成硫化亞鐵沉淀(FeS)，連續(xù)10次以上10%接種液體培養(yǎng)，所得菌種培養(yǎng)液在培養(yǎng)3 d后，使用血球計數(shù)板計數(shù)，菌液濃度均可達到1.827×1010個/mL，菌種生長穩(wěn)定。

2.2 硫酸鹽還原菌混合菌基本生長特征

圖1為該混合菌的基本生長特征。

圖1 混合菌生長特征曲線Fig. 1 Growth characteristic curve of mixed bacteria

從圖1中可以看出，該混合菌的生長遲緩期較短(在8 h以內(nèi))，此后進入對數(shù)生長期，在48 h后進入穩(wěn)定期，最大OD600值為0.777。培養(yǎng)過程中pH值變化呈現(xiàn)先減少再逐步緩慢增加的趨勢。

2.3 硫酸鹽還原菌純菌基本生長特征

為對比研究該混合菌的基本生長特征，購買純種厭氧細菌進行實驗。

從圖2看出，該純菌的生長遲緩期較短，在8 h以內(nèi)，此后進入對數(shù)生長期，在60 h后進入穩(wěn)定期，最大OD600值為0.344，由此可見，該株純菌的總體生長代謝速率低于混合菌。培養(yǎng)過程中pH值變化同樣呈現(xiàn)先減小再逐步緩慢增加的趨勢。

圖2 純菌生長特征曲線Fig. 2 Growth characteristic curve of pure bacteria

2.4 硫酸鹽還原菌混合菌對鎘、鉛去除效果

混合菌對Cd2+的鈍化還原沉淀結(jié)果表明，添加菌體后，出現(xiàn)絮狀顆粒物或黑色固體，初步猜測為SRB的代謝產(chǎn)物H2S與Cd2+、Pb2+沉淀之后形成的硫化物[22]。幾乎所有的反應(yīng)器覆封口膜破裂，并伴有臭雞蛋味，初步推算為生成硫化氫氣體，且接種量越大的氣味越重。對其中的Cd2+、Pb2+的濃度進行分析，見表3。

表3 SRB混合菌對Cd2+、Pb2+去除效果Table 3 Removal efficiency of Cd2+ and Pb2+ by SRB mixed bacteria

從表3看出，SRB混合菌對初始濃度為15mg/L和52 mg/L的含Cd2+、Pb2+溶液均有一定的效果，但不同的Cd2+、Pb2+濃度沉淀效果存在差異：在15和52 mg/L條件下，SRB鈍化還原168 h后，對鎘的去除率分別為94.8%和15.4%，對鉛的去除率分別為93.9%和42.3%，表明SRB混合菌對低濃度(15mg/L) Cd2+、Pb2+去除效果較好，但對高濃度(50mg/L) Cd2+、Pb2+去除效果不理想，這可能是因為在高濃度Cd2+、Pb2+條件下，SRB易受到毒害作用，導(dǎo)致鈍化還原效率降低。

2.5 硫酸鹽還原菌純菌對鎘、鉛去除效果

為了驗證SRB對鎘、鉛的鈍化還原效果，進一步選用純菌考察SRB對鎘、鉛的還原效果，實驗結(jié)果見表4。

表4 SRB純菌對Cd2+去除效果Table 4 Removal efficiency of Cd2+ by SRB pure bacteria

從表4可發(fā)現(xiàn)，隨反應(yīng)時間增加，溶液中的Cd2+、Pb2+逐漸減少，對各濃度Cd2+、Pb2+的還原效果均在187 h處達到最大：187 h時，對10.36 mg/L的Cd2+去除效率達91.6%，52.80 mg/L的Cd2+去除率達83.3%；對9.87 mg/L的Pb2+除效率達90.6%，52.53 mg/L的Pb2+去除率達40.9%，表明SRB對Cd2+、Pb2+確能產(chǎn)生一定的鈍化還原效果。

從表4可以發(fā)現(xiàn)，SRB純菌和混合菌對低濃度Cd2+、Pb2+鈍化還原效果相差不大，Cd2+、Pb2+兩種重金屬離子在SRB作用下的去除率也較為一致，結(jié)合SRB純菌和混合菌的生長規(guī)律（混合菌的總體生長代謝速率高于純菌）以及攀西地區(qū)污染特征，選定SRB混合菌進行下一步研究。

2.6 硫酸鹽還原菌對化學(xué)修復(fù)劑的利用狀況

本次研究擬采用微生物穩(wěn)定化土壤重金屬，同時結(jié)合低分子有機酸進一步絡(luò)合穩(wěn)定土壤重金屬，因此考察了SRB對化學(xué)修復(fù)劑的利用狀況，預(yù)期獲得既可絡(luò)合重金屬土壤又可作為細菌生產(chǎn)底物的化學(xué)絡(luò)合劑。因此嘗試不同的有機物作為絡(luò)合修復(fù)試劑，定量考察FeS的生成量來反映SRB對不同底物的利用狀況。不同碳源和不同F(xiàn)eSO4濃度下生成的粗FeS的濃度見表5。

表5 不同碳源下生成的粗FeS的濃度Table 5 Concentration of crude FeS generated under different carbon sources

從表5中可發(fā)現(xiàn)，在相同摩爾數(shù)不同碳源條件下，丁二酸鈉、乳酸鈉、正丁醇、檸檬酸、蘋果酸、丙酸6種碳源表現(xiàn)出了較好的FeS生成能力，Δ FeS介于5.91 ～ 29.75 g/L，其中檸檬酸和蘋果酸表現(xiàn)較優(yōu)，其Δ FeS分別為29.75、24.91 g/L，其余碳源條件下，SRB生成FeS的能力較差，均低于4.80 g/L。說明SRB對檸檬酸和蘋果酸利用率較高，對丁二酸鈉、乳酸鈉、正丁醇和丙酸利用效果一般，對丙三醇、乙酸鈉、葡萄糖、草酸、丁二酸和乙酸利用效果較差。

從FeS的生成量和實際觀察來看，SRB對檸檬酸和蘋果酸均表現(xiàn)出了較為良好的利用效果，因此選定檸檬酸和蘋果酸作為本研究的化學(xué)絡(luò)合劑，并進一步考察其對土壤的絡(luò)合效果。

2.7 化學(xué)絡(luò)合劑對重金屬形態(tài)的影響

圖4 檸檬酸/蘋果酸對土壤中鉛形態(tài)變化影響Fig. 4 Effects of citric/malic acid on the Pb speciation in soil

化學(xué)絡(luò)合劑對重金屬形態(tài)的影響見圖3、4。從圖3、4可以看出，當(dāng)加入的檸檬酸和蘋果酸較少時（液固比為1:300），能對土壤中重金屬鎘有一定的穩(wěn)定作用，與對照相比，鎘交換態(tài)占比最大下降了25.0%，對鉛的影響不明顯。但隨著檸檬酸和蘋果酸加入量的增加（液固比大于1:200），土壤pH逐漸降低，鎘、鉛可交換態(tài)增加，與對照相比，鎘交換態(tài)占比較大增加了107.4%，鉛可交換態(tài)最大增加了726.9%，重金屬被活化。表明低劑量的檸檬酸和蘋果酸能對土壤重金屬起到一定的絡(luò)合穩(wěn)定作用，而高劑量的檸檬酸和蘋果酸會對土壤起到酸溶作用，導(dǎo)致重金屬被解析。

圖3 檸檬酸/蘋果酸對土樣土壤中鎘形態(tài)變化影響Fig. 3 Effects of citric/malic acid on the Cd speciation in soil

2.8 化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤重金屬的鈍化效果

化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤重金屬的穩(wěn)定化效果見圖5、6。

圖5 化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤中鎘形態(tài)變化影響Fig. 5 Effects of chemical-microbial combined remediation on Cd speciation in soil

從圖5可以看出，化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)在一定程度上能降低土壤中鎘的活性，特別是當(dāng)以1:300的液固比加入檸檬酸、蘋果酸并接入SRB后，鎘可交換態(tài)有一定程度的降低，有機結(jié)合態(tài)有一定程度的提高：SRB作修復(fù)微生物，檸檬酸或蘋果酸作化學(xué)絡(luò)合劑時，鎘可交換態(tài)占比分別降低了60.7%、38.1%，有機結(jié)合態(tài)分別提升了23.2%、16.1%；從圖6可以看出，在土樣中加入檸檬酸或蘋果酸并接入SRB后，鉛的鐵錳結(jié)合態(tài)占比有一定的降低，殘渣態(tài)有一定程度的提高，鉛的鐵錳結(jié)合態(tài)占比最大降低了25.9%，有機結(jié)合態(tài)較高占比最大提高了21.8%。實驗表明化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)能使鎘、鉛朝著更為穩(wěn)定的形態(tài)轉(zhuǎn)變。

圖6 化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤中鉛形態(tài)變化影響Fig. 6 Effects of chemical-microbial combined remediation on Pb speciation in soil

此外，從化學(xué)絡(luò)合修復(fù)與化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)實驗效果來看，其聯(lián)合修復(fù)效果優(yōu)于單絡(luò)合修復(fù)，如：與對照相比，絡(luò)合修復(fù)鎘交換態(tài)占比最大下降了25.0%，而化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)鎘交換態(tài)最大降低達到60.7%，對重金屬鉛（鐵錳結(jié)合態(tài)）也有類似的結(jié)果。

2.9 化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤肥效的影響

本次研究同時考察了化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤肥效的影響，實驗結(jié)果見表6。

表6 化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)對土樣肥效的影響Table 6 Effects of chemical microbial remediation on soil fertility

從表6中可以看出，僅加入檸檬酸和蘋果酸對土壤肥效影響有限：CEC、全氮、堿解氮、速效鉀、有效磷含量變化不明顯，僅對有機質(zhì)含量有略微的提升。但在加入有機酸（檸檬酸/蘋果酸）和微生物菌液后，土壤肥效有一定程度提高，其中有機質(zhì)、CEC、全氮、堿解氮、速效鉀、有效磷最大分別提高了48.5%、7.5%、18.5%、27.6%、16.1%、65.3%、74.3%。實驗表明，僅加入有機酸，對土壤肥效影響不大；加入有機酸和微生物菌液，能在一定程度上提升土壤肥效。

3 分析討論

SRB(Sulpate-Reducing Bacteria, SRB)是一類能通過異化作用進行硫酸鹽還原的細菌，在厭氧/低氧條件時，SRB能通過異化硫酸鹽還原作用將SO42-還原為H2S，重金屬離子可以和H2S反應(yīng)生成金屬硫化物沉淀，從而將重金屬離子沉淀下來，本文中2.4、2.5結(jié)果與此擬合，說明SRB確能穩(wěn)定化重金屬。

在土壤中，SRB穩(wěn)定化重金屬一般認為是通過以下三個途徑[23]：①SRB通過異化作用將SO42-還原為S2-，進而與土壤中重金屬M形成MS，從而穩(wěn)定化土壤重金屬；②硫酸鹽還原過程中生成的S2-會使pH升高，降低了土壤酸性，有利于重金屬離子生成氫氧化物沉淀；③SRB在代謝過程中分解有機物會產(chǎn)生CO2，重金屬離子也可與CO32-反應(yīng)生成碳酸鹽而降低其活性。在本研究中SRB通過這三種途徑將土壤中較為活躍的重金屬形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮榉€(wěn)定的重金屬硫化物，在一定程度上降低了重金屬的遷移性和植物的可利用性。

檸檬酸和蘋果酸等低分子機酸能提供配位基團與重金屬離子發(fā)生酸解絡(luò)合反應(yīng)，調(diào)節(jié)和改變重金屬在土壤中的物理化學(xué)性質(zhì)，使其產(chǎn)生沉淀、吸附、離子交換、腐殖化和氧化還原等一系列反應(yīng)，這種外源物質(zhì)與土壤中重金屬離子結(jié)合后，能夠改變其在土壤中的遷移性[24-25]。此外，部分絡(luò)合劑在直接作用于重金屬的基礎(chǔ)上，還可以作為SRB的有機碳源，促進還原態(tài)硫物質(zhì)的形成，進一步穩(wěn)定化土壤重金屬，從而綜合形成化學(xué)絡(luò)合-微生物穩(wěn)定化處理重金屬的協(xié)同機制。此外，化學(xué)絡(luò)合-微生物穩(wěn)定化處理過程中，在土壤中也會添加一定量的外源營養(yǎng)元素，這些營養(yǎng)物質(zhì)在重金屬穩(wěn)定化處理的過程中對土壤肥效也能起到一定的提升作用。

4 結(jié) 論

（1）本次篩選的SRB混合菌生長遲緩期較短(在8 h以內(nèi))，此后進入對數(shù)生長期，在48 h后進入穩(wěn)定期，而純菌在60 h后進入穩(wěn)定期，純菌的總體生長代謝速率低于混合菌。

（2）SRB混合菌和純菌對鎘、鉛確有良好的鈍化還原效果，在低濃度Cd2+、Pb2+（≤15 mg/L）條件下，去除率較大，可達94.8%、93.9%。

（3）低劑量的檸檬酸和蘋果酸能與土壤重金屬產(chǎn)生絡(luò)合作用，能在一定程度上降低重金屬活性，但隨著有機酸投加量的增加，易使其朝著更易被植物吸收的可交換態(tài)增加。

（4）化學(xué)-微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤中重金屬鎘、鉛能起到一定的鈍化效果，鎘交換態(tài)占比最大降低60.7%、鉛鐵錳結(jié)合態(tài)最大降低了25.9%，同時有助于土壤肥效的提高。