基于BALB/c小鼠的局部淋巴結試驗用于皮膚致敏性評價的實驗研究

胡培麗，阮浩瀾，賀抒，張楊，李波，邢書霞，孫磊，王鋼力，

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京100050；2.廣東省藥品檢驗所，廣東廣州510663；3.成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610000)

小鼠局部淋巴結試驗(local lymph node assay，LLNA)是皮膚致敏多種替代方法中應用最為廣泛的方法之一，Takeyoshi等建立了基于摻入溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的LLNA改良方法(LLNA:BrdU-ELISA)，用示蹤劑替代放射性標記物。LLNA和LLNA:BrdU-ELISA方法中均推薦使用CBA/JN小鼠，該品系小鼠在國內(nèi)供應較少，價格昂貴；而BALB/c小鼠遺傳穩(wěn)定，在國內(nèi)應用廣泛，前期研究結果表明兩品系小鼠只是反應程度有一定的差異，對化學物和化妝品致敏性判斷及致敏強度分級并無顯著影響。由于傳統(tǒng)致敏性試驗要避免受試物出現(xiàn)過度的皮膚刺激反應，因此本研究應用BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA方法對22種化學物和5種化妝品的皮膚刺激性和致敏性同時進行檢測，并與相關傳統(tǒng)試驗數(shù)據(jù)進行比較，進一步對該方法進行評價。

1 材料與方法

1.1 受試物

溶劑為丙酮/橄欖油(acetone/olive oil，AOO)[按4∶1(V/V)配制而成]、丙酮(acetone，ACE)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)或蒸餾水。2,4-二硝基氯苯、間苯二甲酸二甲酯、丁子香酚、異丁子香酚、3-氨基苯酚、反式肉桂醛、己基肉桂醛、水楊酸甲酯、香葉醇、對苯二酚、水楊酸己酯、水楊酸、甲醛、戊二醛、六水硫酸鎳、二氯化鈷、重鉻酸鉀和乳酸均購自Sigma公司；異丙醇、丙二醇、正己烷和苯購自國藥集團化學試劑有限公司。5種化妝品為超市隨機采購，標識齊全，成分標識清晰，使用說明明確。

1.2 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠，雌性，8～10周齡，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心提供，合格證號為SCXK(京)2014-0013。動物試驗環(huán)境為屏障系統(tǒng)動物房，使用許可證號為SYXK(京)20160004，溫度(22±2)℃，濕度40%～60%，動物自由飲食，12 h人工照明。

1.3 試劑和儀器

BrdU粉 劑、BrdU-ELISA試 劑 盒 購 自Roche公司，BrdU粉劑用生理鹽水配成10 mg/mL標記液。SYNERGY HT全自動酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物分組和染毒

試驗設溶劑對照組(AOO、ACE、DMSO或蒸餾水)，陽性對照組(25%己基肉桂醛)和受試物組，上述22種化學物用AOO、ACE或DMSO配成1~3個不同濃度，參照美國替代方法驗證機構間協(xié)調(diào)委員會(Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods，ICCVAM)，5種化妝品產(chǎn)品原液直接涂抹于小鼠雙側耳背，每組4只小鼠。于試驗第1~3天上午9:00在小鼠雙耳背部分別涂抹受試物25 μL，溶劑對照組涂抹相應溶劑，第4天不作處理，第5天腹腔注射BrdU標記液0.5 mL。

1.4.2 取材

BrdU標記液腹腔注射24 h后，摘取小鼠雙側耳朵，用直徑9 mm的打孔器進行耳廓中央打孔稱取質(zhì)量，同時分離小鼠耳部雙側淋巴結，用天平稱量濕質(zhì)量。

1.4.3 淋巴細胞制備

雙側淋巴結用1 mL PBS研磨，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，同時用1 mL PBS沖洗不銹鋼篩網(wǎng)，制成2 mL單細胞懸液，將每只小鼠的淋巴細胞用50 mL離心管定容于15 mL PBS中。

1.4.4 ELISA法檢測細胞增殖

將100 μL細胞懸液加入96孔板中，300 g離心10 min，棄上清，吹干細胞；加200 μL變性固定液，反應30 min，棄去變性固定液；加100 μL抗-BrdU抗體工作液，室溫孵育90 min；棄掉未結合的工作液，用PBS洗液清洗3次，加底物顯色液100 μL，室溫反應20 min，用酶標儀測吸光度(發(fā)射波長、參考波長分別為370和492 nm)。

1.4.5 刺激指數(shù)、EC值計算與致敏性分級

刺激指數(shù)(stimulation index，SI)為受試物組BrdU標記指數(shù)均值與溶劑對照組BrdU標記指數(shù)均值的比值，SI≥1.6為致敏陽性。根據(jù)SI值估算SI為1.6時受試物的濃度(estimated concentration needed to produce an SIof 1.6，EC)，公 式 為：①EC=c+[(1.6-d)/(b-d)]×(a-c)(受試物3個濃度含SI>1.6和SI<1.6)；②EC=2(受試物3個濃度均為SI≥1.6)，其中a、c為相鄰兩點受試物的濃度，b、d為相應SI值。致敏強度分級標準為：EC<0.1為極強，0.1≤EC<1.0為強，1.0≤EC<10為中，10≤EC<100為弱。

1.5 LLNA:BrdU-ELISA結果與傳統(tǒng)實驗數(shù)據(jù)的比較

22種化學物和5種化妝品LLNA:BrdU-ELISA法BALB/c小鼠的致敏性檢測結果與LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠、LLNA放射法、經(jīng)典豚鼠(guinea pig，GP)法及人體實驗文獻數(shù)據(jù)比較。

1.6 致敏性檢測結果評價分析

依據(jù)ICCVAM文獻中化學物的已知致敏性，評價BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法致敏性檢測的陽性預測率、陰性預測率、假陽性率、假陰性率、靈敏度、特異度和準確度。

1.7 統(tǒng)計學方法

計數(shù)每劑量組小鼠的耳廓質(zhì)量、淋巴結質(zhì)量和BrdU標記指數(shù)的均值與標準差，用

x

ˉ±

s

表示，用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。組間比較采用成組方差分析，以

α

=0.05為檢驗水準，

P

<0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 22種化學物和5種化妝品皮膚刺激性

50%己基肉桂醛、5%二氯化鈷、10%乳酸、25%乳酸、50%乳酸組耳廓質(zhì)量與相應溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05或

P

<0.01)，為刺激陽性，其他劑量組化學物均為刺激陰性。5種化妝品中，2號染發(fā)劑組耳廓質(zhì)量與溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，為刺激陽性；其他化妝品均為刺激陰性(表1)。

表1 22種化學物和5種化妝品LLNA:BrdU-ELISA(BALB/c)法皮膚刺激性和致敏性測定結果

(續(xù)表1)

2.2 22種化學物和5種化妝品皮膚致敏性

2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、異丁子香酚、3-氨基苯酚、反式肉桂醛、己基肉桂醛、香葉醇、對苯二酚、水楊酸己酯、甲醛、戊二醛、六水硫酸鎳、二氯化鈷、重鉻酸鉀、乳酸和2號染發(fā)劑為致敏陽性(SI>1.6)，致敏強度分級見表1；其他組SI值均小于1.6，為致敏陰性，見表1。

2.3 LLNA:BrdU-ELISA結果與文獻數(shù)據(jù)比較

查閱相關文獻中的數(shù)據(jù)，異丙醇LLNA法與GP豚鼠法均為致敏陰性，與本研究結果一致，但LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠同時也有致敏假陽性結果，且人體實驗為致敏陽性；正己烷LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠檢測結果為致敏假陽性，而本研究BALB/c小鼠、LLNA放射法及人體實驗結果均為致敏陰性，較一致；乳酸LLNA放射法、豚鼠法及人體實驗結果為致敏陰性，而LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠結果為致敏陰性或陽性，而本研究BALB/c小鼠結果亦為致敏陽性，均為假陽性。苯為全新化學物，ICCVAM文獻中無相關致敏性數(shù)據(jù)。其他化學物BALB/c小鼠致敏結果均與相關文獻一致(部分化學物某些實驗數(shù)據(jù)未知除外)，個別化學物致敏級別稍有差異。5種化妝品BALB/c小鼠致敏結果與傳統(tǒng)的豚鼠實驗結果一致。22種化學物和5種化妝品LLNA:BrdU-ELISA(BALB/c)法檢測的致敏性結果與LLNA:BrdU-ELISA(CBA)、LLNA放射法，經(jīng)典豚鼠法、人體試驗文獻數(shù)據(jù)比較見表2。

表2 22種化學物和5種化妝品LLNA:BrdU-ELISA(BALB/c)法檢測的致敏性與文獻數(shù)據(jù)的比較

2.4 致敏性檢測結果評價分析

苯為全新化學物，ICCVAM文獻中無相關致敏性數(shù)據(jù)。依據(jù)其他21種已知致敏性化學物，評價BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法的致敏性檢測結果：陽性預測率為93.3%(14/15)、陰性預測率為100%(6/6)、假陽性率為14.3%(1/7)、假陰性為0(0/14)、靈敏度為100%(14/14)、特異性為85.7(6/7)、準確度為95.2%(20/21)，見表3。

表3 BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA方法致敏性檢測結果評價分析

3 討論

由于實驗動物的種屬、性別、年齡等因素會影響實驗結果及評價體系，所以選擇合適的動物進行實驗尤為重要。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)指南(TG429、TG442)推薦CBA小鼠，但該品系小鼠在國內(nèi)使用量較少，繁殖周期較長、價格較高，不易推廣應用；而BALB/c小鼠在國內(nèi)應用較為廣泛，遺傳背景明確穩(wěn)定，是替代CBA小鼠的較好選擇。前期研究對兩品系小鼠LLNA:BrdU-ELISA法結果進行了比較，結果表明兩個品系小鼠均可較好地評判化學物或化妝品的致敏性及致敏強度分級。

由于刺激物和致敏物均可對淋巴細胞產(chǎn)生增殖作用，從而致使LLNA產(chǎn)生假陽性，目前有研究通過增選刺激性指標(耳廓質(zhì)量、耳厚差)對化學物的刺激性和致敏性進行全面評價。但測量耳厚差主觀性較強，誤差較大，不易操作，所以本研究選用稱量耳廓質(zhì)量來評價受試物的刺激性。

本研究選用BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法對22種化學物和5種化妝品進行評價，通過耳廓質(zhì)量評價受試物的刺激性，通過淋巴結質(zhì)量、BrdU指數(shù)(SI)和EC評價受試物的致敏性及致敏強度。刺激性結果顯示50%己基肉桂醛、5%二氯化鈷、10%乳酸、25%乳酸、50%乳酸和2號染發(fā)劑為刺激陽性；而ICCVAM文獻中乳酸(≥10%，兔試驗)、己基肉桂醛(>10%，豚鼠試驗)和5%二氯化鈷(豚鼠試驗)為刺激陽性，2號染發(fā)劑傳統(tǒng)皮膚刺激性試驗(兔)結果為刺激陽性；以上結果表明用耳廓質(zhì)量評價受試物的刺激性較為客觀、科學、準確。

致敏性結果與傳統(tǒng)實驗比較：異丙醇與正己烷為非致敏物，本研究結果與LLNA發(fā)射法均為致敏陰性，而ICCVAM中CBA小鼠結果為致敏假陽性，表明LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠反應更為靈敏。前期兩品系小鼠比較研究中也發(fā)現(xiàn)CBA小鼠較BALB/c更高程度地攝取BrdU，反應程度有一定的差異，該發(fā)現(xiàn)與國際上相關學者對不同品系小鼠LLNA研究結果較一致。乳酸亦為非致敏物，但本研究與LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠結果均為致敏假陽性，可能是乳酸的刺激性引起了淋巴細胞增殖，有待于進一步分析淋巴細胞表型，并開展深入研究。

該方法陽性預測率為93.3%、陰性預測率為100%、假陽性率為14.3%、假陰性率為0、靈敏度為100%、特異性為85.7%、準確度為95.2%，表明BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法較好地評價了化學物/化妝品的皮膚致敏性，可在化妝品安全性評價中推廣應用，發(fā)揮其重要作用。