人群PIG-A基因突變測定的研究進(jìn)展

李蕊瑞，張立實(shí)，陳錦瑤，

(1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理與病理學(xué)系，四川成都610041；2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，四川成都610041)

磷脂酰肌醇聚糖A類基因((phosphatidylinositol glycan class A gene，PIG-A)(人類和其他靈長類中為PIG-A，嚙齒動物中為Pig-a)，參與糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)連接蛋白合成，在不同種屬間具有高度保守性。至少有22個基因參與細(xì)胞表面的GPI連接蛋白的生物合成，但只有PIG-A基因位于性染色體，由于女性體內(nèi)成對的X染色體有一條隨機(jī)失活，相比其他位于常染色體上的基因，PIG-A基因突變更易引起GPI表型缺失。研究證實(shí)GPI連接蛋白的缺失與PIG-A基因突變具有對應(yīng)關(guān)系，因此，PIG-A基因突變試驗(yàn)檢測目標(biāo)細(xì)胞表面GPI連接蛋白表型缺失，該方法靈敏、微創(chuàng)、可重復(fù)采樣、高通量、有較長的檢測窗、操作簡便。最先被用作診斷陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)的金標(biāo)準(zhǔn)，此后有動物試驗(yàn)和體外試驗(yàn)用于遺傳毒理學(xué)領(lǐng)域，自2011年人成熟紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)的PIG-A基因突變檢測首次被報(bào)道后，人群PIG-A基因突變測定相關(guān)研究被嘗試用于人體真實(shí)暴露于復(fù)雜環(huán)境因素的風(fēng)險(xiǎn)評估。

目前，多家實(shí)驗(yàn)室已建立了動物試驗(yàn)或體外試驗(yàn)方法，用于化學(xué)物遺傳毒性的檢測，各實(shí)驗(yàn)室間有良好的重現(xiàn)性和技術(shù)可轉(zhuǎn)移性，已建立Pig-a試驗(yàn)結(jié)果的公共數(shù)據(jù)庫。國際人用藥物注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會議M7指南將Pig-a基因突變試驗(yàn)列入藥物雜質(zhì)遺傳毒性試驗(yàn)中細(xì)菌誘變試驗(yàn)結(jié)果陽性的追加試驗(yàn)。而人群PIG-A突變測定尚在探索中，與動物試驗(yàn)和體外試驗(yàn)相比，其優(yōu)勢在于：①樣品來自人體，可避免動物試驗(yàn)結(jié)果外推到人的不確定性；②可反映人群真實(shí)暴露下的健康效應(yīng)；③可評估動物模型等無法模擬的暴露效應(yīng)和真實(shí)環(huán)境的混合暴露效應(yīng)，有助于擴(kuò)大待評估的危險(xiǎn)因素范圍。本文將從人群PIG-A基因突變測定方法、突變水平、影響突變的因素及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 人群PIG-A基因突變測定方法及突變水平

1.1 PIG-A基因突變測定方法

PIG-A基因突變的檢測方法有流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometric methods，F(xiàn)CM)和有限稀釋法。流式細(xì)胞術(shù)用熒光抗體標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞的GPI連接蛋白，用流式細(xì)胞儀定量檢測；部分研究用帶磁珠的抗體將數(shù)量相對較少的目標(biāo)細(xì)胞群富集，研究證實(shí)有或無免疫磁珠富集的情況下檢測的PIG-A基因突變率高度相關(guān)(r=0.973)。此外，也有研究通過梯度離心和細(xì)胞分離液分離出粒細(xì)胞進(jìn)行檢測。有限稀釋法以產(chǎn)氣單胞菌溶素作為選擇劑通過細(xì)胞培養(yǎng)分選并擴(kuò)增突變細(xì)胞，后續(xù)可進(jìn)行基因水平的檢測。

1.1.1 目標(biāo)細(xì)胞

研究表明骨髓來源的細(xì)胞沒有額外優(yōu)勢。現(xiàn)有研究主要分析了外周血來源的網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte，RET)、RBC、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的人群PIG-A基因突變率。結(jié)果表明RET的PIG-A基因突變率高于RBC，RET在早期的敏感性優(yōu)于RBC；且該細(xì)胞有細(xì)胞核，不受補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血的影響，可相對準(zhǔn)確反映突變率。但外周血中RET只占紅細(xì)胞總數(shù)的0.5%~1.5%，檢測耗時。部分研究通過免疫磁珠富集RET提高檢測效率，但也增加了實(shí)驗(yàn)步驟和成本。相比之下，RBC量大易得，但檢測窗相對RET晚，無核DNA，易受補(bǔ)體攻擊發(fā)生溶血。與RET相比，

PIG-A

基因突變率在RBC中被低估，且隨著突變率增加，RBC會大大低估突變率。但有研究證實(shí)RBC和RET自發(fā)GPI表型缺失率的趨勢一致、相關(guān)性較好。而粒細(xì)胞中

PIG-A

基因突變率的檢測先從外周血中獲得純化粒細(xì)胞，再進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，較為復(fù)雜。綜上，RET是研究者推薦的

PIG-A

檢測的首選目標(biāo)細(xì)胞。從組織中分離細(xì)胞極易損傷細(xì)胞表面標(biāo)記，不利于識別位于細(xì)胞表面的GPI連接蛋白缺失，因此對實(shí)體組織分離的細(xì)胞的檢測尚未見報(bào)道。不過，有研究者在體外模型中采用了HepG2細(xì)胞檢測

PIG-A

基因突變，證實(shí)苯并(a)芘等可引起HepG2細(xì)胞的突變率顯著增加，可作為體外遺傳毒性測試的實(shí)體組織來源的細(xì)胞模型。目前建立的GPI傳感器檢測

PIG-A

突變的方法設(shè)計(jì)了熒光蛋白在GPI合成過程中進(jìn)行標(biāo)記，不需要對細(xì)胞表面抗體染色，以此為例的新方法的應(yīng)用可能有助于拓寬可檢測的細(xì)胞類型，從而增加該方法在人群中應(yīng)用時的器官水平的遺傳毒性終點(diǎn)。

1.1.2 染色方案

研究目的、目標(biāo)細(xì)胞及不同成熟程度細(xì)胞表面標(biāo)記的特異性表達(dá)差異會影響抗體和目標(biāo)細(xì)胞的選擇。文獻(xiàn)中總結(jié)了目前的抗體組合。測定人群

PIG-A

基因突變水平較為成熟的方法是FCM，推薦以抗人CD235ab-APC標(biāo)記紅細(xì)胞、以抗人CD59-FITC標(biāo)記GPI連接蛋白。PNH診斷多采用嗜水氣單胞菌溶素變異體(aeromonas hydrophila lysin variant，F(xiàn)LAER)標(biāo)記粒細(xì)胞和單核細(xì)胞；因?yàn)镕LAER可以和所有白細(xì)胞的GPI位點(diǎn)結(jié)合，相比于CD59標(biāo)記，能更敏感地檢測GPI缺失表型，但也僅限于白細(xì)胞。因此有研究者認(rèn)為同時檢測2種不同細(xì)胞譜系和2種不同GPI錨鏈蛋白有助于降低假陽性率。也有研究者通過檢測CD59、CD55、CD24均為陰性的細(xì)胞降低假陽性率?，F(xiàn)有關(guān)于健康人群的

PIG-A

基因突變測定的方法和結(jié)果見表1。

表1 健康人PIG-A基因突變測定結(jié)果

1.2 人群PIG-A基因突變水平

由表1可知正常人RBC和RET的

PIG-A

基因突變率均值均小于1.0×10，而粒細(xì)胞和T細(xì)胞的

PIG-A

基因突變率均值約高出10倍；淋巴細(xì)胞

PIG-A

基因突變率分布范圍較寬(1×10~1×10)。多項(xiàng)研究表明健康人

PIG-A

基因突變率個體內(nèi)變異小而個體間變異大，且存在個別異常高值。有結(jié)果顯示健康受試者RBC中PIG-A基因突變率相差可超過30倍，RET中相差約20倍。有研究將人群突變率和變異與實(shí)驗(yàn)動物的作了比較，發(fā)現(xiàn)人的基線值高于大鼠檢測值的90%置信區(qū)間上限，且數(shù)據(jù)的變異較大。

2 PIG-A基因突變的影響因素

2.1 年齡

健康人中PIG-A基因突變率在各年齡段相對穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)217名健康人的突變率與年齡無線性相關(guān)；在對其中3名健康人在300多天內(nèi)多次檢測后發(fā)現(xiàn)：同一個體的突變率變化較?。谎芯空哒J(rèn)為原因是紅細(xì)胞壽命有限，且由突變了的造血祖細(xì)胞在不斷更新，所以在較長時間里沒有累積性。另外97名健康人的年齡與PIG-A基因突變率的相關(guān)性較差。在鈾暴露的退伍軍人中也發(fā)現(xiàn)PIG-A基因突變率與年齡無關(guān)。但有研究表明52名健康人的RET和RBC的PIG-A基因突變率與年齡呈正相關(guān)，而且同一個體的突變率在不同時點(diǎn)變異較小。另一項(xiàng)研究也表明健康人RBC的PIG-A基因突變率與年齡呈正相關(guān)。

2.2 性別

萊昂效應(yīng)指出女性體內(nèi)有一條X染色體隨機(jī)失活，位于X染色體上的PIG-A基因突變率應(yīng)無性別差異。但Dobrovolsky等發(fā)現(xiàn)拉丁裔男性的中位數(shù)突變率低于女性；Cao等在亞裔健康人的研究中發(fā)現(xiàn)RBC中的PIG-A基因突變率在男性中高于女性，職業(yè)性鉛暴露人群中RBC中的PIG-A基因突變率也有性別差異(男高于女)；Dertinger等發(fā)現(xiàn)女性的RET中PIG-A基因突變率略高于男性，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另一項(xiàng)研究(n=300)也表明RBC的突變率在女性中較高，但不同性別間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 種族

目前對多人種正常人PIG-A基因突變率的研究尚未見報(bào)道。僅在一項(xiàng)存在鈾暴露的退伍軍人中的報(bào)道涉及非裔、亞裔、拉美裔、印第安人、高加索人，但該研究對此未作進(jìn)一步分析，尚無法得知人種差異對PIG-A基因突變率的影響。

2.4 突變來源

突變發(fā)生階段以及具有突變表型細(xì)胞成熟過程對不同時間點(diǎn)測得的突變率可能造成影響。Hu等指出健康個體中的PIG-A基因突變發(fā)生在分化的祖細(xì)胞水平，而非干細(xì)胞水平。目前尚未在健康人中檢測到發(fā)生了PIG-A基因突變的造血干細(xì)胞，但健康人中GPI表型缺失細(xì)胞卻持續(xù)存在。而非自發(fā)的PIG-A基因突變主要發(fā)生在造血干細(xì)胞中，干細(xì)胞來源的突變紅細(xì)胞可在血液中持續(xù)蓄積，相比于造血祖細(xì)胞來源的突變表型，造血干細(xì)胞來源的突變表型持續(xù)時間更長；而在造血祖細(xì)胞發(fā)生突變時，在外周血中出現(xiàn)突變表型的時間要早于來自造血干細(xì)胞的突變。

2.5 行為方式和營養(yǎng)

研究表明PIG-A基因突變與是否吸煙、吸煙年限無關(guān)。動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)不良會增加Pig-a基因突變率，肥胖可通過引起代謝障礙、炎癥、氧化應(yīng)激使得Pig-a突變率增加，但一項(xiàng)橫斷面研究(n=300)中發(fā)現(xiàn)PIG-A基因突變率與BMI、水果攝入量、肉類攝入量無關(guān)，但與低蔬菜攝入量有關(guān)。上述研究提示該方法或可用于檢測非化學(xué)因素的致突變效應(yīng)，但對結(jié)果的不一致需進(jìn)一步探討。

2.6 其他

治療等干預(yù)措施會影響PIG-A基因突變測定結(jié)果，Araten等指出PNH患者中RBC的PIG-A基因突變率受到了輸血的影響；發(fā)生溶血或接受輸血治療后，RBC中突變數(shù)量可被低估。有研究者推測啟動子區(qū)域甲基化會導(dǎo)致PIG-A基因表達(dá)減少，從而影響GPI連接蛋白的產(chǎn)生，但尚未被證實(shí)。此外，炎癥和與炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)相關(guān)的細(xì)胞分裂增加可能會導(dǎo)致IBD患者PIG-A基因突變率升高。

3 PIG-A基因突變測定在人群中的應(yīng)用

使用了咪唑硫嘌呤治療的36名IBD患者的PIG-A基因突變率比同期健康對照組高，但其突變率與該藥物的治療時間或總暴露量無關(guān)。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)267名鉛接觸工人的PIG-A基因突變率[(10.9±10.7)×10]高于健康對照，且與累積血鉛水平相關(guān)。一項(xiàng)橫斷面研究卻表明PIG-A基因突變率均未隨鉛的暴露量和累計(jì)暴露量增加而變化，被檢測的2 634名研究對象 的PIG-A基因突變率的均數(shù)為6.0×10(P=3.0×10，P=10.0×10)，研究者認(rèn)為可能的原因是鉛可引起DNA或染色體損傷，但不具誘變作用。另一項(xiàng)研究中，27名平均年齡為61.9歲(26~81歲)的不同類別癌癥患者RBC的PIG-A基因突變率在0~49.67×10之間，個體間差異較大，其中2名患者使用了有遺傳毒性的吉西他濱或喃氟啶化療后，突變率明顯高于健康對照，但因缺乏基線數(shù)據(jù)而因果難明。該研究中，突變率與健康人無明顯差異的患者也有其他使用了有遺傳毒性藥物的化療史，但未對此進(jìn)行進(jìn)一步研究。30名乳腺癌患者在放療前、放療后3周以及停止治療后10周進(jìn)行了PIG-A基因突變測定，結(jié)果表明，放療未能誘導(dǎo)粒細(xì)胞的PIG-A基因突變率增加，研究者認(rèn)為可能是不同試驗(yàn)方法的靈敏度、研究對象和干預(yù)措施的異質(zhì)性等影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Cao等研究發(fā)現(xiàn)使用順鉑和依托泊苷聯(lián)合治療的患者RBC中的PIG-A基因突變率約增加了3倍。這提示可以通過測定PIG-A基因突變反映人體細(xì)胞異常突變，但仍需進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)與展望

綜上，近年來已有少量關(guān)于人群中PIG-A基因突變的報(bào)道，RET是首選的目標(biāo)細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道的健康人PIG-A基因突變率的個體間變異大，PIG-A基因突變率與年齡、性別等因素的關(guān)聯(lián)尚無一致結(jié)論，更多潛在的影響因素仍在探索中，目前在非健康人群中開展的相關(guān)研究尚不能得到確切的結(jié)論。且現(xiàn)有研究的樣本量均較小，研究因素與PIG-A基因突變率的相關(guān)性在不同研究間并不一致，因此，有必要進(jìn)行更大樣本量的人群研究，獲得人群的基線水平，明確機(jī)體因素和環(huán)境因素對個體間變異的作用；并縱向收集暴露前后數(shù)據(jù)、設(shè)同期健康人群對照，優(yōu)化研究設(shè)計(jì)并建立標(biāo)準(zhǔn)的方法和體系，以便該方法用于人群真實(shí)的環(huán)境暴露風(fēng)險(xiǎn)評估。