傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與EB病毒DNA濃度的相關(guān)性研究

李海霞, 陶永明, 趙秋霞, 王立和, 高曉鵬

(山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院 兒內(nèi)科, 山西 運(yùn)城, 044000)

傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)是一種由EB病毒感染引起的急性或亞急性全身性疾病，臨床特征多為不規(guī)則發(fā)熱、肝脾及淋巴結(jié)腫大、咽峽炎、周圍血象出現(xiàn)異常淋巴細(xì)胞，臨床結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查可確診[1]。IM好發(fā)于小兒時期，且一年四季都可發(fā)病，應(yīng)用抗生素治療無效，而使用抗病毒藥物治療有效。IM可引起消化、呼吸、神經(jīng)、血液、泌尿等多系統(tǒng)損害，嚴(yán)重者還可能引發(fā)腫瘤，再加上其臨床癥狀多樣，早期較易發(fā)生漏診、誤診[2]。人體中存在輔助性T細(xì)胞1(Th1)、輔助性T細(xì)胞2(Th2)、輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)4類T細(xì)胞亞群，其中Treg是具有抑制性作用的負(fù)調(diào)控功能細(xì)胞，其在人體中發(fā)揮維持自身免疫穩(wěn)定、預(yù)防自身免疫性疾病等重要作用。報道[3]顯示，這類T細(xì)胞除與免疫性疾病有關(guān)，還與移植、感染等密切相關(guān)。本研究探討IM患兒的Treg水平變化及其與EB病毒DNA(CEBV-DAN)濃度的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院在2018年8月—2020年8月收治的42例IM患兒作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn): 符合IM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]者; 初次發(fā)病者; 未應(yīng)用過糖皮質(zhì)激素類藥物、細(xì)胞毒性藥物或免疫調(diào)節(jié)劑者; 患兒家屬對本研究知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn): 非首次發(fā)病者; 合并其他病毒感染者; 近期應(yīng)用過免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素類藥物者。其中男23例，女19例，年齡3～12歲，平均(5.3±2.1)歲。另選取同期進(jìn)行健康體檢的30例健康兒童作為對照組，對照組兒童無任何過敏性疾病史或感染史，其中男19例，女11例，年齡2～11歲，平均(4.8±1.7)歲。2組兒童的性別構(gòu)成比、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

標(biāo)本采集: 2組受檢兒童均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采血。2組使用真空采集管采集1 mL外周靜脈血，使用EDTA抗凝管保存，快速送至流式細(xì)胞室進(jìn)行T細(xì)胞檢測。觀察組患兒還需采集2 mL外周靜脈血，以EDTA抗凝管保存，送至PCR室進(jìn)行EBV-DNA檢測。觀察組患兒在急性期進(jìn)行T細(xì)胞亞群與EBV-DNA濃度檢測，在恢復(fù)期進(jìn)行1次EBV-DNA濃度檢測。

主要儀器: 美國BD公司生產(chǎn)的FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀; 科大創(chuàng)新股份有限公司生產(chǎn)的KD640型低速離心機(jī); 姜堰新康醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的XK96-B快速混勻器、微量移液器; 北京鑫諾美迪公司生產(chǎn)的ABI-7300實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)儀。檢測試劑包括PerCP(多甲藻紅素-葉綠素)標(biāo)記的CD45單克隆抗體, FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的CD4單克隆抗體, PE(藻紅蛋白)標(biāo)記的CD127、CD8單克隆抗體, APC(別藻藍(lán)蛋白)標(biāo)記的CD3、CD25單克隆抗體，溶血素，均由美國BD公司提供。EB病毒核酸擴(kuò)增熒光定量檢測試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份公司提供。

檢驗(yàn)方法: (1) T細(xì)胞亞群。檢測前先確認(rèn)標(biāo)本是否凝血，凝血標(biāo)本需重新采血、處理。對標(biāo)本進(jìn)行編號，放入試管架。在試管中分別加入單克隆抗體A: CD4-FITC/CD8-FE/CD45-PerCP/CD3-APC, B: CD4-FITC/CD127-PE/CD45-PerCP/CD25-APC, 各10 μL。每支試管中加入20 μL抗凝全血，混合后避光孵育20 min。在每支試管中加入90 μL紅細(xì)胞裂解液，孵育15 min, 使紅細(xì)胞充分裂解。加入0.5 mL生理鹽水，離心5 min(轉(zhuǎn)速1 000 r/min), 摒棄上清液。剩余液體加入適量生理鹽水，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，測定CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127-比例。(2) EBV-DNA: ① 陰性質(zhì)控品處理。以8 000 r/min的速度離心5 s, 吸取50 μL液體加入滅菌離心管(0.5 mL)中，加入DNA提取液混合均勻, 100 ℃恒溫處理10 min, 離心備用。② 標(biāo)本處理。取1 mL全血標(biāo)本加入1 mL生理鹽水混合。另取試管加淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的全血移至加有淋巴細(xì)胞分離液的試管中，離心后吸取白細(xì)胞層，離心保留沉淀物，加入DNA提取液，恒溫處理，再次離心備用。③ 臨界陽性質(zhì)控品與強(qiáng)陽性質(zhì)控品處理。方法均與陰性質(zhì)控品處理方法相同。④ 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。取若干PCR反應(yīng)管，各加入2 μL處理后的標(biāo)本、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品或陽性定量參考品，離心后放入儀器樣品槽中進(jìn)行檢測，記錄檢測結(jié)果。以5×102copies/μL為檢測極限值，若檢測數(shù)值超過該極限值則判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 T細(xì)胞亞群

觀察組患兒的CD3+、CD8+水平均高于對照組, CD4+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127-水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果對比

流式細(xì)胞散點(diǎn)圖顯示, IM患兒CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞占CD3+T淋巴細(xì)胞的百分比為25.3%(圖1), 正常兒童CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞占CD3+T淋巴細(xì)胞的百分比為36.7%(圖2)。

圖1 IM患兒流式細(xì)胞散點(diǎn)圖

圖2 正常兒童流式細(xì)胞散點(diǎn)圖

2.2 EBV-DNA檢測結(jié)果

觀察組患兒的EBV-DNA陽性檢出率為85.71%, 高于對照組的3.33%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組EBV-DNA陽性檢出情況[n(%)]

觀察組患兒急性期的EBV-DNA含量為(76.62±5.10)×103copies/mL, 恢復(fù)期的EBV-DNA含量為(0.68±2.30)×103copies/mL。觀察組患兒急性期的EBV-DNA含量高于恢復(fù)期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 相關(guān)性分析

IM患兒急性期的EBV-DNA濃度與CD3+、CD8+水平均呈正相關(guān)關(guān)系，與CD4+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127-水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。見表3。

表3 IM患兒急性期EBV-DNA濃度與T細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析

3 討 論

EB病毒為皰疹病毒屬，為嗜淋巴細(xì)胞DNA病毒，具有明顯的轉(zhuǎn)化與潛伏特性。兒科多種疾病特別是發(fā)熱性疾病的發(fā)生都與EB病毒感染有關(guān)。多數(shù)兒童在感染EB病毒后會表現(xiàn)為IM, 一些患兒還會因病情控制不當(dāng)導(dǎo)致病情遷延不愈，或繼發(fā)霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤等惡性疾病[5]。

IM的臨床癥狀多樣，且出現(xiàn)時間不確定，臨床主要通過實(shí)驗(yàn)室檢查和臨床癥狀進(jìn)行診斷，但是傳統(tǒng)的外周血淋巴細(xì)胞檢查、嗜異性凝集反應(yīng)有一定的假陽性與假陰性率。BV病毒特異性抗體檢測有較高的靈敏度與特異性，但對一些免疫力低下或使用過免疫抑制劑的患兒難以獲得準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。在分子生物學(xué)技術(shù)的持續(xù)發(fā)展下, PCR技術(shù)在血清、血漿EB病毒DNA含量檢測中的應(yīng)用也越來越多[6]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患兒的EBV-DNA陽性檢出率顯著高于對照組，達(dá)到了85.71%, 說明EBV-DNA檢測對IM有較高的靈敏度，是早期診斷IM的可靠方法。結(jié)果還顯示，觀察組患兒恢復(fù)期的EBV-DNA含量明顯低于急性期，這可能是因?yàn)镮M是一種自限性疾病，感染BV病毒的B淋巴細(xì)胞在不斷增殖的過程中，也會釋放病毒顆粒而引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)可在4～6周后使BV病毒細(xì)胞明顯減少，從而使疾病自愈。

CD3+是T細(xì)胞共同的表面標(biāo)志，標(biāo)記了所有T淋巴細(xì)胞。自然Treg主要為CD4+細(xì)胞，其在外周血CD4+T淋巴細(xì)胞總數(shù)中占5%～10%, 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用, CD4+CD25+是Treg細(xì)胞的主要表型, CD4+CD25+CD127-則是近期被發(fā)現(xiàn)的新型Treg標(biāo)志物。除CD4+Treg外, CD8+Treg在免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用，其能通過多種途徑調(diào)控免疫應(yīng)答，抑制自身免疫性疾病的發(fā)生，誘導(dǎo)移植耐受，并能發(fā)揮腫瘤免疫調(diào)節(jié)等作用。研究[7]顯示, IM的發(fā)病過程中存在著明顯的細(xì)胞免疫異常情況，這可能是因?yàn)槿梭w感染EB病毒后，病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，細(xì)胞溶解后病毒被釋放到血液中。因人體內(nèi)B細(xì)胞中存在著EB病毒受體，所以血液中的EB病毒會最先感染B細(xì)胞，之后T細(xì)胞、NK細(xì)胞相繼受累，從而釋放出大量的細(xì)胞因子?；罨疊細(xì)胞會刺激CD8+細(xì)胞增殖，同時B細(xì)胞還會與CD8+細(xì)胞結(jié)合而出現(xiàn)凋亡，使淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)出自限性增殖特點(diǎn)。由此可見，對于EB病毒感染引起的B細(xì)胞增殖, CD8+細(xì)胞發(fā)揮著重要的抑制作用，而CD4+細(xì)胞則能促進(jìn)多種免疫細(xì)胞增殖，從而清除EB病毒。據(jù)此認(rèn)為在EBV感染中，細(xì)胞免疫起著決定性作用, CD4+/CD8+比值是臨床用于反映人體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo), CD4+/CD8+比值降低通常預(yù)示著機(jī)體發(fā)生了免疫系統(tǒng)損傷。本研究結(jié)果顯示，相比健康兒童, IM患兒急性期的CD3+、CD8+水平明顯更高，而CD4+、CD4+/CD8+水平明顯更低。這一結(jié)果說明EB病毒感染使機(jī)體發(fā)生了強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，受EB病毒感染者的細(xì)胞免疫功能明顯下降，這與相關(guān)文獻(xiàn)[8]報道結(jié)論相符。學(xué)者[9]指出, IM患兒普遍存在免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，從而削弱了機(jī)體的抗病毒能力，這也是導(dǎo)致IM患兒病情加重的主要原因。在人體免疫細(xì)胞中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一群具有免疫抑制作用的免疫細(xì)胞，能對效應(yīng)T細(xì)胞的過度活化發(fā)揮抑制作用，從而起到維持機(jī)體免疫穩(wěn)定、避免自身免疫發(fā)生的作用。CD4+CD25+CD127-在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中都扮演著十分重要的角色，但是目前關(guān)于CD4+CD25+CD127-與EB病毒感染相關(guān)性的報道還較少。本研究對CD4+CD25+CD127-與EB病毒感染的關(guān)系進(jìn)行探究，結(jié)果顯示IM患兒外周血中的CD4+CD25+CD127-比例明顯低于正常兒童，這提示在IM發(fā)病過程中可能有CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)T細(xì)胞的參與。本研究還發(fā)現(xiàn), CD4+CD25+CD127-與EBV-DNA濃度有負(fù)相關(guān)關(guān)系。有文獻(xiàn)[10]報道, IM患兒的CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)T細(xì)胞水平與CD19+CD23+水平呈正相關(guān), CD4+CD25+CD127-可能會抑制EB病毒轉(zhuǎn)化為永生細(xì)胞。EB病毒在感染B細(xì)胞后，可誘發(fā)CD23持續(xù)表達(dá)，并促使其成為永生細(xì)胞, EB濃度越高，永生細(xì)胞越多，由此也間接反映CD4+CD25+CD127-能夠?qū)B病毒發(fā)揮一定的抑制作用。

綜上所述, IM患兒的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平與EBV-DNA濃度呈負(fù)相關(guān)，提示IM患兒在急性期普遍存在免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，且免疫功能紊亂程度與EB病毒感染量密切相關(guān)。