國(guó)際FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果與分析

秦 婧，王琳帆，魏思宇，陳奕杉，陳鴻劍，鄭玉紅

（1.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048；2.富平縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西富平 711700）

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力的外部質(zhì)量活動(dòng)，尋求并參加能力驗(yàn)證是合格評(píng)定機(jī)構(gòu)的責(zé)任和義務(wù)[1]。英國(guó)FAPAS分析實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（Food Analysis Performance Assessment Scheme）是專(zhuān)門(mén)從事食品檢測(cè)分析方面的能力評(píng)估體系，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間測(cè)試結(jié)果的比對(duì)來(lái)判定實(shí)驗(yàn)室能力的合格評(píng)定活動(dòng)。FAPAS為世界約3 000家實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)門(mén)提供醫(yī)學(xué)、食品檢測(cè)方面的能力驗(yàn)證活動(dòng)；FAPAS建立了一套完整的能力驗(yàn)證提供者的評(píng)價(jià)體系。該體系在全世界各國(guó)的食品分析實(shí)驗(yàn)室迅速普及，它已是食品分析領(lǐng)域全球第一的國(guó)際評(píng)價(jià)體系[2]。FAPAS在2007年已與CNAS（中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)）達(dá)成互認(rèn)。為提高檢驗(yàn)檢測(cè)能力和水平，本實(shí)驗(yàn)室參加FAPAS于2021年4月的乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)能力驗(yàn)證，希望通過(guò)此次FAPAS能力驗(yàn)證來(lái)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員的能力，維持實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測(cè)水平。依據(jù)的方法是GB 4789.10—2016第二法（平板計(jì)數(shù)法），并對(duì)北京陸橋、廣州環(huán)凱兩個(gè)廠家生產(chǎn)的檢測(cè)配套培養(yǎng)基進(jìn)行了比對(duì)。

1 材料與方法

1.1 試劑

氯化鈉（分析純）來(lái)自天津天力化學(xué)試劑有限公司；Baird-Parker瓊脂平板、血瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂平板（tryptic soy agar,TSA）、革蘭氏染色液、腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth,BHI）和凍干血漿，均分別來(lái)自北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司和廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

均質(zhì)器（寧波新芝生物科股份有限公司 SCIENTZ-11）；生化培養(yǎng)箱（上海悅豐儀器儀表有限公司SPX-150B-Ⅱ）；生物顯微鏡（奧林巴斯廣州工業(yè)有限公司 CX23）；可調(diào)式混勻儀（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京股份有限公司 MX-S）；生物安全柜（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 BSC-1300ⅡA2）。

1.3 方法

1.3.1 能力驗(yàn)證樣品的接收和確認(rèn)

實(shí)驗(yàn)室收到FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌能力驗(yàn)證樣品1份，樣品編碼是M263E14,樣品為10 g乳粉，塑料瓶包裝，并確認(rèn)樣品完整性。

1.3.2 能力驗(yàn)證樣品的前處理和水化

根據(jù)FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌（M263E14）能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書(shū)的說(shuō)明，開(kāi)啟樣品前應(yīng)先將樣品放置在室溫下30 min。在二級(jí)生物安全柜中以無(wú)菌操作開(kāi)啟樣品，將樣品置于提前準(zhǔn)備好的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用少量無(wú)菌生理鹽水充分沖洗樣品容器并將其吸入到放有樣品的均質(zhì)袋中，最終使水化的生理鹽水總量為90 mL，用均質(zhì)器充分混勻，即為10-1樣品勻液。后續(xù)依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）第二法（平板計(jì)數(shù)法）進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.3 樣品的稀釋

該步驟在生物安全柜中以無(wú)菌操作進(jìn)行。用1 mL無(wú)菌吸管吸取10-1樣品勻液1 mL,沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液面）,充分振搖試管，制成10-2的樣品勻液。按以上操作程序,依次制備10-3、10-4樣品勻液。后續(xù)操作分別使用北京陸橋和廣州環(huán)凱生產(chǎn)的配套試劑進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.4 樣品的接種和培養(yǎng)

在3個(gè)B-P平板上分別加入0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL樣液進(jìn)行涂布。由于GB 4789.10—2016第二法（平板計(jì)數(shù)法）存在涂布不均勻和B-P平板接種量較大不易吸收的情況，故同時(shí)在5個(gè)B-P平板上各加入0.2 mL樣液進(jìn)行涂布。注意B-P平板應(yīng)提前一天配制并放于冰箱冷藏，因?yàn)樾迈r配制的B-P平板表面易有水珠。涂布后,將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱（36±1） ℃培養(yǎng)1 h，等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板,倒置放于（36±1） ℃培養(yǎng)24～48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落計(jì)數(shù)及鑒定

樣品培養(yǎng)48 h后，北京陸橋和廣州環(huán)凱的B-P平板上均僅有一種菌落，且菌落呈黑色、有光澤、表面光滑、凸起、濕潤(rùn)、有淺色的邊緣,周?chē)@以不透明圈,其外有一清晰帶，依據(jù)GB 4789.10—2016第二法確定其為典型菌落。將10-3稀釋度的菌落依據(jù)GB 4789.10—2016進(jìn)行血平板劃線、染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如表1、表2所示。

表1 3個(gè)B-P平板上加入接種量為0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

表2 5個(gè)B-P平板上各加入接種量為0.2 mL的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 討論

3個(gè)B-P平板上分別加入接種量為0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的樣液，采用北京陸橋配套試劑檢測(cè)樣品的菌落總數(shù)結(jié)果為1.0×105CFU/g，采用廣州環(huán)凱配套試劑檢測(cè)樣品的菌落總數(shù)結(jié)果為9.3×104CFU/g；5個(gè)B-P平板上各加入接種量為0.2 mL的樣液，采用北京陸橋配套試劑檢測(cè)樣品的菌落總數(shù)結(jié)果為1.1×105CFU/g，采用廣州環(huán)凱配套試劑檢測(cè)樣品的菌落總數(shù)結(jié)果為9.8×104CFU/g。樣液接種量為0.2 mL的方法，采用北京陸橋和廣州環(huán)凱試劑的樣品菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果均要大于樣液接種量分別為0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的方法，因?yàn)镚B 4789.10—2016第二法（平板計(jì)數(shù)法）本身存在接種量較大和涂布不均勻的情況，沒(méi)有接種量為0.2 mL的方法有利于菌落生長(zhǎng)，這一點(diǎn)與已有陸其聰?shù)热薣3]與王洪亮等人[4]的相關(guān)研究一致。因?yàn)楸敬蜦APAS能力驗(yàn)證采用方法為GB 4789.10—2016第二法（平板計(jì)數(shù)法），日常樣品檢測(cè)采用北京陸橋配套試劑，故上報(bào)結(jié)果為1.0×105CFU/g。此次國(guó)際FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)為滿意，且Z值為0，說(shuō)明上報(bào)結(jié)果是為此次能力驗(yàn)證指定值，由此可見(jiàn)該實(shí)驗(yàn)室具備金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)分析能力。

3 注意事項(xiàng)

對(duì)于新取得檢驗(yàn)檢測(cè)資質(zhì)的微生物實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，承接能力驗(yàn)證前需要進(jìn)行大量的準(zhǔn)備工作，現(xiàn)就準(zhǔn)備工作做一個(gè)總結(jié)，以期為新實(shí)驗(yàn)室或新進(jìn)檢測(cè)人員提供參考。

①準(zhǔn)備工作。得知要參加能力驗(yàn)證后應(yīng)提前準(zhǔn)備相關(guān)試劑、器具和設(shè)備，如提前驗(yàn)證商品化培養(yǎng)基，提前準(zhǔn)備所用三角瓶和試管，且不與日常檢測(cè)相混淆，提前確定使用的培養(yǎng)箱是否潔凈、是否在計(jì)量有效期內(nèi)等。②作業(yè)指導(dǎo)書(shū)。收到樣品后，應(yīng)首先確認(rèn)樣品的完整性并記錄收樣日期，不要急于準(zhǔn)備相關(guān)試劑，應(yīng)先制定作業(yè)指導(dǎo)書(shū)和確定檢驗(yàn)依據(jù)。③試劑配制。新鮮配制的B-P平板較軟、不好涂布，應(yīng)提前1 d配制并在第2 d使用；使用前確認(rèn)B-P平板干燥、無(wú)水珠，若有水珠可提前放置在培養(yǎng)箱中待水珠消失；9 mL生理鹽水應(yīng)在使用時(shí)分裝，不可分裝好后再滅菌，因?yàn)闇缇^(guò)程中會(huì)使9 mL生理鹽水增加或減少，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。④試驗(yàn)操作。樣品應(yīng)提前從冰箱中取出并恢復(fù)至室溫，可安排兩人同步試驗(yàn)，一人取樣并進(jìn)行10-1倍稀釋?zhuān)♂尯煤?，兩人分別進(jìn)行后續(xù)稀釋和加樣，進(jìn)行人員比對(duì)；涂布時(shí)每個(gè)稀釋梯度使用一根涂布棒，不可每個(gè)B-P平板用一根涂布棒，會(huì)造成樣液損失，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；注意整個(gè)操作應(yīng)在20 min內(nèi)完成，因?yàn)榧?xì)菌20～30 min繁殖一代[5]；完成試驗(yàn)后，若B-P平板上樣液不吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱（36±1） ℃培養(yǎng)1 h，等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板,倒置培養(yǎng)。⑤計(jì)數(shù)。按照檢驗(yàn)依據(jù)所描述的菌落形態(tài)進(jìn)行典型和可疑菌落計(jì)數(shù)，并一定拍照保存，平板前后均要拍照，平板背面更方便觀察典型菌落透明圈，便于識(shí)別典型菌落，照片可作為科室學(xué)習(xí)資料保存。