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    小陷胸湯對高血脂小鼠血脂及免疫功能的影響

    2021-10-10 08:37:50曾江琴孫勤國徐鴻婕丁曉明牟艷杰蔣躍文
    現(xiàn)代免疫學(xué) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:小陷百分比脾臟

    曾江琴,孫勤國,徐鴻婕,丁曉明,牟艷杰,蔣躍文

    (1. 武漢市第三醫(yī)院 中醫(yī)科,武漢 430060;2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)臨床學(xué)院,武漢 430061)

    高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)是指由于機體血脂水平過高導(dǎo)致的全身性脂質(zhì)代謝紊亂性疾病,會誘發(fā)冠心病、腦栓塞、動脈粥樣硬化等一系列心腦血管疾病[1-2]。隨著生活水平的提高,高蛋白、高脂肪食物的攝取量日益增多,同時缺乏運動,導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過度積累,形成HLP[3]。HLP是中老年人的常見病,近些年發(fā)現(xiàn),患病人群仍在不斷增加并呈逐漸年輕化發(fā)展[4]。因此,調(diào)控脂質(zhì)代謝,降低血脂水平對于心腦血管疾病的防治具有重要意義[5]。他汀類藥物是臨床上治療HLP的主要藥物,但其治療靶點單一,長期服用存在多種不良反應(yīng)[6]。因此,探尋有效且安全的HLP治療藥物具有重要意義。

    在中醫(yī)學(xué)上,HLP被認為屬于“痰濁”、“瘀血”等范疇[7]。小陷胸湯最早出自《傷寒論》,由黃連、瓜蔞、半夏三味藥組成,具有清熱化痰、寬胸散結(jié)的功效[8]。本研究以高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立HLP模型,探究小陷胸湯對模型小鼠血脂以及免疫功能的影響,旨在為HLP的防治提供新的方向和理論參考。

    1 材料

    1.1 實驗動物36只5周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量20~22 g,購自三峽大學(xué)實驗動物中心。小鼠飼養(yǎng)于22~26 ℃,相對濕度50%~60%環(huán)境中,晝夜交替照明12 h/12 h。

    1.2 實驗藥物小陷胸湯(黃連3 g、瓜蔞30 g、半夏12 g),由武漢市第三醫(yī)院中藥房提供,用傳統(tǒng)方法浸泡、煎煮、過濾、濃縮,制成煎劑,調(diào)制至每毫升含生藥0.12、0.06及0.03 g(根據(jù)人與小鼠體表面積換算得出的劑量),低溫冷藏備用。

    1.3 實驗試劑洛伐他汀,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;高脂飼料,購自北京華阜康生物科技股份有限公司;總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)檢測試劑盒,購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;小鼠血清CRP ELISA檢測試劑盒,購自武漢貝茵萊生物科技有限公司;PBS、鈣離子載體離子霉素、布雷非德菌素A(brefeldin A,BFA),購自北京索萊寶科技有限公司;佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)購自Sigma-Aldrich公司;小鼠抗CD40-FITC、抗CD40L-PE、抗IL-4-PE、抗IFN-γ-PE、抗CD4-FITC抗體,購自eBioscience公司;破膜劑,購自BD公司。

    1.4 實驗儀器全自動生化分析儀,購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;酶標儀,購自Labsystems公司;CO2常溫培養(yǎng)箱,購自賽默飛世爾科技有限公司;FACS,購自艾森生物(杭州)有限公司 。

    2 方法

    2.1 HLP小鼠模型的構(gòu)建適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,對照組小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料,模型組飼喂高脂飼料。飼喂8周后,夜間饑餓處理對照組和模型組小鼠,尾靜脈取血,檢測血清中TC和TG水平,模型組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義即為HLP模型構(gòu)建成功。

    2.2 分組和給藥將小鼠隨機分為6組:陰性對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組,每組6只。除陰性對照組外,其余各組小鼠均進行HLP模型的構(gòu)建。建模成功后,低、中、高劑量組小鼠分別灌胃0.03、0.06和0.12 g/mL小陷胸湯,陽性對照組小鼠灌胃2.5 mg/kg洛伐他汀,陰性對照組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。給藥頻率為1次/d,連續(xù)8周。末次給藥結(jié)束后,稱取各小鼠體質(zhì)量。1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,處死后采集小鼠主動脈血液分離血清并收集小鼠脾臟、肝臟及主動脈血管組織,計算肝臟、脾臟指數(shù)。

    肝臟指數(shù)=(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%;脾臟指數(shù)=(脾質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%

    2.3 小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的檢測采用全自動生化分析儀測定小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平,操作嚴格按照生化試劑盒說明書進行。

    2.4 FACS檢測血管組織CD40+/CD40L+細胞百分比取各組主動脈血管組織樣本,用含5%雙抗的PBS漂洗后剪碎組織塊,經(jīng)0.25%胰酶及0.1% Ⅱ型膠原酶(體積比1∶1)37 ℃消化20 min。收集單細胞懸液,175×g離心10 min,棄上清液,PBS漂洗后備用。用100 μL 流式緩沖液重懸細胞,取1×106個細胞于1.5 mL離心管中,每管加入2 μL 抗CD40-FITC和抗CD40L-PE抗體,4 ℃避光孵育30 min;400×g離心5 min,棄上清液;400 μL PBS重懸細胞,使用FACS檢測。

    2.5 FACS檢測脾臟組織Th1、Th2百分比取各組小鼠脾臟組織樣本,剪碎,37 ℃消化30 min,收集細胞懸液。經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾,175×g離心10 min,棄上清液,PBS漂洗1次。取1×106個細胞于1.5 mL離心管中,每管加入2 μL PMA(50 ng/mL)、離子霉素(2 μg/mL)和BFA(3 μg/mL)的混合物,培養(yǎng)6 h。PBS漂洗1次,4 ℃、400×g離心5 min,棄上清液;100 μL流式緩沖液重懸細胞,加入2 μL抗CD4-FITC抗體,4 ℃避光孵育30 min;加入1 mL固定劑,避光孵育20 min,4 ℃、400×g離心5 min,棄上清液;加入1 mL破膜劑,避光孵育40 min,4 ℃、400×g離心5 min,棄上清液;PBS重懸細胞,加入2 μL抗IFN-γ-PE、抗IL-4-PE抗體,4 ℃避光孵育45 min;400 μL PBS重懸細胞,使用FACS檢測。

    2.6 ELISA檢測小鼠外周血CRP水平按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作,稀釋標準品,繪制標準曲線。將各組小鼠血清加入待測樣本孔中,依次加入抗CRP-Biotin抗體、酶標試劑、顯色劑和終止液,于酶標儀檢測各孔光密度D(450 nm)值,通過標準曲線方程計算各組小鼠血清CRP水平。

    3 結(jié)果

    3.1 小陷胸湯對HLP小鼠臟器指數(shù)的影響與對照組比較,模型組小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高(均P<0.05);與模型組比較,低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低(均P<0.05),高劑量組和陽性對照組小鼠脾臟指數(shù)顯著下降(P<0.05, 表1)。

    表1 各組小鼠臟器指數(shù)的變化

    3.2 小陷胸湯對HLP小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響與對照組比較,模型組小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平顯著升高(均P<0.05),HDL-C水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低(均P<0.05),HDL-C水平顯著升高(均P<0.05, 表2)。

    表2 各組小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的變化

    3.3 小陷胸湯對HLP小鼠血清CRP水平的影響與對照組比較,模型組小鼠血清CRP水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清CRP水平顯著降低(均P<0.05, 圖1)。

    注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖1 各組小鼠血清CRP水平的變化

    3.4 小陷胸湯對HLP小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比的影響與對照組比較,模型組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比顯著下調(diào)(均P<0.05, 圖2)。

    注:A. FACS檢測各組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比;B. 各組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比統(tǒng)計結(jié)果。與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖2 各組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比的變化

    3.5 小陷胸湯對HLP小鼠脾臟Th1、Th2百分比的影響與對照組比較,模型組小鼠脾臟細胞中Th1百分比顯著增加(P<0.05),Th2百分比顯著減少(P<0.05);與模型組比較,低劑量組小鼠脾臟細胞中Th1和Th2百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);中、高劑量組和陽性對照組小鼠脾臟細胞中Th1百分比顯著減少(均P<0.05),Th2百分比顯著增加(均P<0.05, 圖3)。

    注:A~B. FACS檢測各組小鼠脾臟細胞中Th1和Th2百分比;C~D. 各組小鼠脾臟中Th1和Th2百分比的統(tǒng)計結(jié)果。與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖3 各組小鼠脾臟細胞中Th1和Th2百分比的比較

    4 討論

    血脂異常表現(xiàn)為外周血TC、TG、LDL-C等一種或多種指標水平升高,或者HDL-C水平降低[9-10]。LDL-C參與肝臟中TC向肝外轉(zhuǎn)運的過程,其水平過高會導(dǎo)致TC、TG沉積,堵塞血管[11]。而HDL-C參與將外周組織中的TC轉(zhuǎn)運至肝臟的分解代謝,能夠減少TC在外周組織血管的沉積,有利于心血管系統(tǒng)健康[12]。CRP是一種典型的急性相血漿蛋白,常作為衡量臨床炎癥反應(yīng)的非特異性標志物[13]。研究表明,CRP與高血糖、高血脂及多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。本研究采用高脂飼料飼喂小鼠以構(gòu)建HLP模型,結(jié)果顯示,模型組小鼠血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高(均P<0.05),HDL-C水平顯著下降(P<0.05),符合HLP動物模型評價指標[15],說明本研究成功構(gòu)建了HLP小鼠模型。經(jīng)不同劑量小陷胸湯給藥治療后,HLP小鼠CRP、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平得到不同程度改善,其中高劑量組的逆轉(zhuǎn)效果最為明顯。這提示小陷胸湯能抑制CRP水平,上調(diào)HDL-C,加速肝外TC和TG向肝內(nèi)轉(zhuǎn)運的代謝,即小陷胸湯具有降低HLP小鼠血脂的功效。

    免疫損傷、炎癥反應(yīng)在HLP及其相關(guān)疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[16],因此,調(diào)節(jié)免疫功能是HLP相關(guān)疾病的主要治療策略之一。免疫器官的質(zhì)量和相關(guān)指標是評價機體免疫系統(tǒng)狀態(tài)的重要指標。脾臟為體積最大的外周免疫器官,可對血源性抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)[17]。研究顯示,HLP小鼠脾臟指數(shù)降低,機體免疫功能下降[18-19]。肝臟在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用,研究發(fā)現(xiàn),改善肝臟脂質(zhì)代謝和減輕炎癥反應(yīng)可對高脂飲食誘導(dǎo)的HLP發(fā)揮較好的治療效果[20]。CD40/CD40L通路在免疫應(yīng)答的啟動中發(fā)揮重要作用[21],抑制CD40/CD40L復(fù)合物水平可顯著減輕炎癥反應(yīng)程度[22]。Th1/Th2平衡在免疫調(diào)節(jié)過程中具有關(guān)鍵性作用,根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果顯示,調(diào)節(jié)脾臟Th1/Th2平衡向Th2偏移可發(fā)揮炎癥反應(yīng)抑制作用,從而實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)[23]。

    本研究中,造模后小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著升高,CD40+/CD40L+細胞百分比顯著增加,Th1百分比顯著上升,Th2百分比顯著下降,而中劑量和高劑量小陷胸湯治療HLP小鼠后,臟器指數(shù)顯著下降,CD40+/CD40L+細胞百分比顯著減少,Th1百分比顯著下降,Th2百分比顯著上升,提示小陷胸湯能夠改善HLP小鼠臟器,調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)。

    綜上所述,小陷胸湯可降低HLP小鼠TC、TG和LDL-C水平,提高HDL-C水平,改善小鼠免疫功能。但是,目前其作用靶點尚不明確,還需進一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理手段分析其主要活性成分及可能靶點并進行驗證,從而為小陷胸湯的應(yīng)用推廣提供更多實驗依據(jù)。

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