蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲產(chǎn)卵和繁殖的影響

許嘉麟，談家金，郝德君

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)病又稱松樹萎蔫病，能造成松樹快速枯萎死亡[1]。松材線蟲病的原發(fā)地是北美洲，但近年來在亞洲流行，其中中國(guó)是遭受該病危害最嚴(yán)重的國(guó)家[2-6]。我國(guó)十多個(gè)省區(qū)的松樹遭受該病危害而大面積死亡，據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有6 000萬hm2松林正面臨著松材線蟲病大流行的威脅[7]。多年來，人們采用多種方式對(duì)松材線蟲病進(jìn)行防治，方法大致可分為物理防治、化學(xué)防治、生物防治等。由于化學(xué)防治的快速有效，近年來滅殺松材線蟲的化學(xué)藥劑迅速興起，目前市場(chǎng)上主要化學(xué)藥劑有豐索磷、甲維鹽可溶粒劑、涕滅威、呋喃丹和克線磷等[8]。如Lu 等[9]用低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)的阿維菌素苯甲酸鹽對(duì)松材線蟲進(jìn)行毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，松材線蟲的產(chǎn)卵數(shù)、孵化率、運(yùn)動(dòng)頻率和發(fā)育均受到顯著抑制。然而，使用這些化學(xué)試劑進(jìn)行防治的同時(shí)造成的環(huán)境污染、生態(tài)破壞不容忽視。因此，環(huán)境友好型生物防治方法中微生物應(yīng)用于防治松材線蟲病受到了廣泛的關(guān)注[10]。

植物寄生線蟲的生物防治主要通過引入從自然界中篩選的線蟲天敵降低線蟲的種群數(shù)量，或者通過生物所產(chǎn)生的代謝毒素殺死線蟲[11]。其中殺線蟲細(xì)菌(nematocidal bacteria)是線蟲的一大類重要天敵，其生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)，已經(jīng)成為生物防治線蟲新的方向[12-15]。如黃冰紛等[16]篩選出的C611，經(jīng)鑒定為鏈霉菌屬，其發(fā)酵液處理松材線蟲7 d，線蟲死亡率達(dá)85%，將C611發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，確定其活性成分為呋喃酮(furaltadone);用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%呋喃酮純?nèi)芤禾幚硭刹木€蟲5 d，死亡率達(dá)96%。目前研究較多的殺線蟲細(xì)菌有芽孢桿菌屬(Bacilllus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和巴氏桿菌屬(Pasteurella)等[17-19]，其中芽孢桿菌的研究最為深廣。李亮亮等[20]在濕地松(Pinuselliotti)上分離出1株殺線細(xì)菌蠟樣芽孢桿菌(B.cereus) NJSZ-13菌株，研究發(fā)現(xiàn)該菌株的濾液處理線蟲48 h后，線蟲死亡率高達(dá)到100%，濾液分別稀釋2、4和10倍后處理松材線蟲，隨稀釋倍數(shù)的增加，培養(yǎng)濾液的殺線活性逐漸降低。使用105cfu/mL濃度的菌懸液處理線蟲48 h后，線蟲死亡率達(dá)81.5%。這表明蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲有較強(qiáng)的毒殺作用。為進(jìn)一步了解蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲的生防作用，筆者研究了其對(duì)松材線蟲的產(chǎn)卵量、卵孵化率和繁殖等方面的影響，從而為更深入地研究其殺線機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)取自南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室。

蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室談家金課題組[15]從南京中山陵濕地松分離得到，用于松材線蟲生防細(xì)菌，現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M2016660。

松材線蟲AMA3蟲株分離自安徽省馬鞍山的黑松，現(xiàn)保存于南京林業(yè)大學(xué)松材線蟲蟲株資源庫。

NA固體培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g/L，氯化鈉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.2～7.4。

NB培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g/L，氯化鈉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，pH 7.2～7.4。

1.2 菌懸液、發(fā)酵液和發(fā)酵濾液的獲得

將保存的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株在NA平板上進(jìn)行活化后接入NB培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，于10 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清液，用等體積無菌水懸浮菌體，即為供試菌懸液。同樣條件培養(yǎng)4 d，獲得的搖培液即為發(fā)酵液。將搖培液于10 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，上清液即為發(fā)酵濾液。

1.3 無菌松材線蟲卵的獲得

采用貝爾曼法分離獲得適量的松材線蟲蟲液，將線蟲液和 30%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫按體積比1∶1的比例混合后靜置10 min，于離心機(jī)中離心5 min(3 000 r/ min)，吸去上清液，留松材線蟲液約 1.5 mL，繼續(xù)加入0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的硫酸鏈霉素1.5 mL，混合均勻后靜置5 min。加入無菌水洗滌線蟲 3～5 次。最后保留約 2 mL蟲液，在線蟲操作臺(tái)中移接到無污染的灰葡萄孢平板上用脂膜封口，放入25 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d。繼而在無菌條件下漏取線蟲于離心管，吸取足量(約10 000條/皿)線蟲至35 mm的培養(yǎng)皿中。產(chǎn)卵2～4 h后用高溫滅菌的毛刷和無菌水除去線蟲，保留皿底的蟲卵。在45倍昆蟲解剖鏡下挑取5～10個(gè)卵于NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，若NA培養(yǎng)基無細(xì)菌污染，即可確定獲得無菌蟲卵。

1.4 蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲的殺線率測(cè)定

在無菌條件下，松材線蟲蟲株在灰葡萄孢上繁殖5 d 后，用無菌水將線蟲從灰葡萄孢上洗下，置于60 mm培養(yǎng)皿中待其產(chǎn)卵。線蟲產(chǎn)卵2～4 h 后，將蟲體懸浮液倒掉后加入少量無菌水，放置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，待卵孵化，將二齡幼蟲吸到灰葡萄孢上培養(yǎng)5 d 后，采用貝爾曼漏斗法分離線蟲，無菌水沖洗線蟲3次，在2 mL離心管中加入50 μL蟲液(含有1 000條線蟲)，并在離心管中分別加入NJSZ-13菌株的菌懸液、發(fā)酵液及發(fā)酵濾液的原液(T1)、5倍稀釋液(T5)和10倍稀釋液(T10)各1 mL，其中菌懸液和發(fā)酵液的原液濃度為3×108cfu/mL。對(duì)照為無菌水和NB培養(yǎng)基，4個(gè)重復(fù)。分別在24和48 h后將離心管震蕩使蟲液均勻后吸取20 μL在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)已死線蟲數(shù)和總線蟲數(shù)，每個(gè)離心管數(shù)3次，求平均值計(jì)算殺線率，使用 SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Excel制圖。

殺線率=死蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100%。

1.5 松材線蟲產(chǎn)卵量的統(tǒng)計(jì)

在1.5 mL離心管中挑入10對(duì)雌雄4齡幼蟲，并分別向離心管中加入菌懸液、發(fā)酵液和發(fā)酵濾液的原液(T1)、10倍稀釋液(T10)、100倍稀釋液(T100)各1 mL，其中菌懸液和發(fā)酵液的原液濃度為3×108cfu/mL。無菌水、NB培養(yǎng)基為對(duì)照。每處理4個(gè)重復(fù)，25 ℃下培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后將離心管的卵液沖洗至皿底畫有網(wǎng)格線的35 mm培養(yǎng)皿中，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)卵量和已孵化的二齡幼蟲，使用Excel制圖和 SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6 松材線蟲卵孵化率

無菌條件下，在皿底畫有網(wǎng)格線的35 mm的小皿中加入100 μL卵液(約含400個(gè)卵)，處理組加入菌懸液、發(fā)酵液和發(fā)酵濾液的10(T10)、100(T100)和1 000(T1 000)倍稀釋液各1 mL，其中菌懸液和發(fā)酵液的原液濃度為3×108cfu/mL。無菌水、NB培養(yǎng)基為對(duì)照。然后用無菌水加至2 mL，每處理4個(gè)重復(fù)，置于半徑為5.0 cm，高為0.5 cm的大培養(yǎng)皿中，封口；25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12、24、36 h，統(tǒng)計(jì)各皿的線蟲數(shù)，計(jì)算其孵化率和相對(duì)抑制率，使用GraphPad Prism 8.0.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖。

孵化率=孵化的二齡幼蟲數(shù)/原卵數(shù)×100%；

相對(duì)抑制率=(對(duì)照孵化線蟲數(shù)-處理孵化線蟲數(shù))/對(duì)照孵化線蟲數(shù)×100%。

1.7 松材線蟲繁殖力

無菌條件下，將100 μL線蟲液(含500條松材線蟲)分別與100 μL NJSZ-13菌株菌懸液、發(fā)酵液、發(fā)酵濾液的原液(T1)、5倍稀釋液(T5)和10倍稀釋液(T10)混合接入60 mm培養(yǎng)皿的灰葡萄孢中，在25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，用貝爾曼法分離線蟲并計(jì)數(shù)。其中菌懸液和發(fā)酵液的原液濃度為3×108cfu/mL，無菌水和NB培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理4重復(fù)，使用GraphPad Prism 8.0.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲的殺線作用

由蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲24、48 h的殺線效果(圖1A)可知，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液殺線效果較強(qiáng)，而菌懸液較弱；NJSZ-13菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液和菌懸液的原液和5倍稀釋液的殺線效果與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。隨著菌液稀釋倍數(shù)的增加，殺線效果逐漸下降。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，殺線率提高。NJSZ-13菌株的發(fā)酵液和發(fā)酵濾液原液處理24 h后的殺線率即高達(dá)100%，而其菌懸液原液處理48 h后的殺線率僅為81.47%。稀釋5倍的發(fā)酵濾液和發(fā)酵液處理48 h后，松材線蟲死亡率仍分別高達(dá)86.58%和87.04%。

不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。There are extremely significant differences between different uppercase letters (P<0.01), significant differences (P<0.05) between different lowercase letters among treatments. The same below.圖1 蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲24、48 h的殺線效果和處理24 h的產(chǎn)卵量Fig.1 Killing effect of Bacillus cereus NJSZ-13 strain on B. xylophilus in 24 and 48 hours and its spawning number treated 24 hours

2.2 NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲產(chǎn)卵量的影響

從蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲處理24 h的產(chǎn)卵量(圖1B)中可以看出，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液和菌懸液均降低了松材線蟲的產(chǎn)卵量，隨著稀釋倍數(shù)的增大，處理組的產(chǎn)卵量逐漸增多。發(fā)酵液、發(fā)酵濾液和菌懸液的原液處理后，松材線蟲產(chǎn)卵量極顯著地低于對(duì)照組(P<0.01)。當(dāng)稀釋10倍后，發(fā)酵液和發(fā)酵濾液仍極顯著地低于對(duì)照，菌懸液與對(duì)照也有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)稀釋100倍后，菌懸液與對(duì)照的產(chǎn)卵數(shù)相差不大，而發(fā)酵液和發(fā)酵濾液與對(duì)照仍有顯著差異。

2.3 NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲卵孵化的影響

菌株NJSZ-13的10倍稀釋液對(duì)松材線蟲卵動(dòng)態(tài)孵化的影響結(jié)果如圖2A顯示， 在12～36 h測(cè)試期間，菌懸液、發(fā)酵液和發(fā)酵濾液的孵化率一直低于無菌水對(duì)照和NB培養(yǎng)基對(duì)照。在12 h時(shí)，菌懸液與對(duì)照無菌水、發(fā)酵液和發(fā)酵濾液與對(duì)照NB培養(yǎng)基相比有極顯著差異(P<0.01)，其孵化率分別為76.83%、94.75%、60.43%、62.59%和92.35%。在24 h時(shí)，菌懸液、發(fā)酵液和發(fā)酵濾液對(duì)松材線蟲卵孵化有顯著影響(P<0.05)，但3種處理之間差異不顯著。在36 h時(shí)僅發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理的卵與對(duì)照有顯著差異。

圖2 NJSZ-13菌株10～1 000倍稀釋液處理松材線蟲卵后其孵化率的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of hatch ability of B. xylophilus eggs treated with 10-1 000 times dilution of NJSZ-13 strain

由NJSZ-13菌株的10倍稀釋液處理松材線蟲卵后其孵化率的動(dòng)態(tài)變化(圖2B)可知，菌株NJSZ-13的100倍稀釋液對(duì)松材線蟲卵的抑制作用遠(yuǎn)小于10倍稀釋液。在12 h時(shí)，菌懸液處理的孵化率為84.68%，與對(duì)照無菌水無顯著差異(P>0.05)，而發(fā)酵液和發(fā)酵濾液(79.55%、79.26%)相對(duì)于對(duì)照NB培養(yǎng)基來說，有顯著性差異(P<0.05)。

由NJSZ-13菌株100倍稀釋液處理松材線蟲卵后其孵化率的動(dòng)態(tài)變化(圖2C)可以看出，在12～36 h的測(cè)試期間，各處理曲線無限靠近對(duì)照曲線，這表明菌株NJSZ-13的1 000倍稀釋液對(duì)松材線蟲卵孵化均無顯著影響(P>0.05)。

2.4 NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲繁殖力的影響

從蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲繁殖力的影響(圖3)可以看出，NJSZ-13菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、菌懸液均能不同程度地影響松材線蟲的繁殖力。發(fā)酵液、發(fā)酵濾液和菌懸液的原液和5倍稀釋液處理松材線蟲后其繁殖力與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)。用發(fā)酵液、發(fā)酵濾液和菌懸液的10倍稀釋液處理松材線蟲后，菌懸液對(duì)線蟲繁殖力無明顯的影響，發(fā)酵液和發(fā)酵濾液仍與對(duì)照有顯著差異(P<0.05)。

圖3 蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲繁殖力的影響Fig.3 Effect of Bacillus cereus NJSZ-13 strain on the reproduction of B. xylophilus

3 討 論

近年來，利用細(xì)菌防治松材線蟲的研究愈發(fā)深廣。張婉君等[21]篩選出的1株蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3菌株，其發(fā)酵濾液具有高效殺線活性，發(fā)酵濾液4、8和20倍稀釋液處理48 h后，松材線蟲的校正死亡率分別為99.55%、88.32%和22.52%。曾麗瓊等[22]用馬尾松內(nèi)篩選出的短小芽孢桿菌Z11-2菌株和G36菌株的培養(yǎng)濾液處理松材線蟲24 h，松材線蟲的死亡率分別達(dá)92%和89%，48 h后線蟲消解率分別是87.4%和77.5%。彭雙[23]篩選得到13株對(duì)松材線蟲具有較高殺線蟲活性的植物內(nèi)生細(xì)菌菌株，這些菌株的發(fā)酵上清液對(duì)松材線蟲處理24 h后，殺線蟲率均達(dá)到了100%。本研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株的發(fā)酵液和發(fā)酵濾液對(duì)線蟲的致死率在處理48 h后可達(dá)到100%，而菌懸液為81.47%。發(fā)酵濾液5倍和10倍稀釋液處理48 h后，松材線蟲死亡率分別達(dá)到91.79%和80.57%，菌懸液的5倍和10倍稀釋液處理48h后，松材線蟲死亡率分別達(dá)到77.64%和61.21%。表明該菌株的發(fā)酵濾液和菌懸液中都含有殺線物質(zhì)。NJSZ-13菌株對(duì)線蟲的毒性作用不只是直接殺死，也體現(xiàn)在對(duì)線蟲的產(chǎn)卵量、卵孵化率和繁殖力等多方面的影響。丁國(guó)春等[24]研究表明枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus)AR11菌株的菌懸液兩倍、5倍稀釋液和上清液的兩倍稀釋液均明顯抑制南方根結(jié)線蟲卵孵化, 菌懸液10倍稀釋液和上清液5倍稀釋液對(duì)卵的孵化有促進(jìn)作用，但促進(jìn)機(jī)理不明確。王貽蓮等[25]發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌BCJB01菌株上清液和菌懸液對(duì)番茄根結(jié)線蟲2齡幼蟲和即將孵化出2齡幼蟲的卵均有完全致死作用。在本研究中發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液和菌懸液均降低了松材線蟲的產(chǎn)卵量，隨著稀釋倍數(shù)的增大，產(chǎn)卵量逐漸增多。發(fā)酵液、發(fā)酵濾液和菌懸液的原液處理后，松材線蟲產(chǎn)卵量極顯著地低于對(duì)照組。另外，NJSZ-13菌株的菌懸液、發(fā)酵液和發(fā)酵濾液均對(duì)松材線蟲卵的孵化有抑制作用，且抑制強(qiáng)度與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，與處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明NJSZ-13菌株可能主要影響松材線蟲卵孵化的時(shí)間，即推遲卵的孵化。線蟲繁殖力是其產(chǎn)卵量、卵孵化率等各項(xiàng)指標(biāo)的綜合體現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NJSZ-13菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液和菌體菌懸液均降低了松材線蟲的繁殖力，這與文中繁殖力相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果相一致。李亮亮等[20]篩選并鑒定出的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)LYMC-3菌株和蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲有高效的拮抗作用，即兩株菌濾液處理線蟲48 h后，死亡率均達(dá)到100%，其中菌株LYMC-3的培養(yǎng)濾液還可使線蟲蟲體出現(xiàn)消解。用NJSZ-13菌株的105cfu/mL菌懸液浸漬松材線蟲48 h后，線蟲死亡率達(dá)81.5%。尹艷楠等[26]采用人工皮接法將松材線蟲接種到兩年生馬尾松幼苗上，將20 mL濃度為4×108cfu/mL的發(fā)酵液、菌懸液和發(fā)酵濾液的10倍稀釋液灌注到兩年生馬尾松根部，來比較蠟樣芽孢桿菌不同發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)松材線蟲病的防治效果。結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌菌懸液對(duì)松材線蟲病有一定的預(yù)防效果，達(dá)33%，發(fā)酵液和無菌發(fā)酵濾液不能對(duì)松材線蟲病起到預(yù)防作用。本研究在李亮亮等[20]和尹艷楠等[26]的研究基礎(chǔ)上，更加廣泛地研究了NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲的防治機(jī)制。

關(guān)于蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對(duì)松材線蟲的致病機(jī)理還需進(jìn)一步研究，依據(jù)前人和本研究的結(jié)果，在后續(xù)研究中應(yīng)全面實(shí)現(xiàn)對(duì)松材線蟲殺線物質(zhì)和分子機(jī)制方面的研究，可繼續(xù)探究以明確發(fā)酵液的具體殺線物質(zhì)以及該物質(zhì)的調(diào)控機(jī)制。