坡面方胸材小蠹鑒定與風(fēng)險(xiǎn)分析

王立超，陳鳳毛*，仇才樓，唐進(jìn)根，丁學(xué)農(nóng)，任吉星

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037；2.江蘇省森林病蟲害防治檢疫站，江蘇 南京 210036；3.江蘇省東臺(tái)林場(chǎng)，江蘇 鹽城 224200)

坡面方胸材小蠹(Euwallaceainterjectus)，原屬于鞘翅目(Coleoptera)小蠹科(Scolytidae)材小蠹族(Xyleborini)材小蠹屬(xyleborus)[1]，后因材小蠹屬蟲數(shù)眾多且不同小蠹生活習(xí)性和形態(tài)特征多樣，1980年Wood[2]將材小蠹屬提升，并對(duì)材小蠹屬內(nèi)昆蟲重新進(jìn)行分類，坡面材小蠹、闊面方胸小蠹(E.validus)以及小圓方胸小蠹(E.fornicatus)等也逐漸由材小蠹屬歸類到方胸材小蠹屬(Euwallacea)之中。此外，小蠹科也由原先獨(dú)立的科級(jí)分類單元降級(jí)為象蟲科下的一個(gè)亞科單元[3]。因此，目前坡面方胸材小蠹分類地位屬于鞘翅目，象甲科(Curculionidae)小蠹亞科(Scolytinae)方胸材小蠹屬。

方胸材小蠹屬昆蟲具有很強(qiáng)的入侵性，中國(guó)、日本、美國(guó)等國(guó)家口岸曾多次截獲多種隨木材調(diào)運(yùn)的方胸材小蠹屬昆蟲，其中包括坡面方胸材小蠹[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道坡面方胸材小蠹為東亞本土物種，目前分布在美國(guó)、日本、阿根廷、泰國(guó)、馬來西亞、孟加拉國(guó)等地[5-10]，于1976年在美國(guó)紐約地區(qū)發(fā)現(xiàn)，2011年首次報(bào)道在泰國(guó)橡膠樹中發(fā)現(xiàn)該小蠹，2019年在阿根廷枯死楊樹內(nèi)第1次發(fā)現(xiàn)該小蠹蟲分布。有文獻(xiàn)記載坡面方胸材小蠹在我國(guó)境內(nèi)有分布，也曾多次在來自馬來西亞、菲律賓、新加坡等國(guó)家的木材中發(fā)現(xiàn)該小蠹蟲[8,11-12]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)資料表明坡面方胸材小蠹已在我國(guó)江蘇、安徽、浙江等地區(qū)分布[13-15]，而國(guó)內(nèi)尚有大部分地區(qū)有寄主植物分布，因此該小蠹蟲在國(guó)內(nèi)仍存在進(jìn)一步擴(kuò)散的可能。

由于小蠹蟲自身體型小，且近似種之間差異不明顯，因此很難用肉眼準(zhǔn)確鑒定，如坡面方胸材小蠹和闊面方胸材小蠹十分相似，兩者區(qū)別僅在于小蠹蟲鞘翅斜面上第2溝間部齒瘤分布特征[5]，造成小蠹蟲種類鑒定困難；此外若在檢疫過程中僅有幼蟲或小蠹蟲殘?bào)w存在，此時(shí)小蠹蟲的形態(tài)檢疫則根本無法進(jìn)行。如今，分子生物學(xué)技術(shù)逐漸運(yùn)用到小蠹蟲鑒定工作中，已有文獻(xiàn)報(bào)道用于小蠹蟲分子鑒定的基因有線粒體基因COI、核糖體基因28S rDNA、核蛋白編碼基因CAD和ArgK基因以及延長(zhǎng)因子基因EF-1α[16]，但是國(guó)內(nèi)對(duì)小蠹蟲分子鑒定研究較少[15,17]，對(duì)坡面方胸材小蠹的研究更是鮮見[4,18]。

2019年7月，在江蘇省東臺(tái)林場(chǎng)有大量楊樹死亡，調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一種小蠹蟲，數(shù)量十分龐大。但由于其體型小，加之小蠹蟲不同種類間的形態(tài)相似，難以準(zhǔn)確區(qū)分。為此采用形態(tài)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)枯死楊樹內(nèi)小蠹蟲的種類進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)該小蠹蟲在中國(guó)境內(nèi)的分布進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期為準(zhǔn)確識(shí)別坡面方胸材小蠹及防控該小蠹蟲進(jìn)一步傳播提供參考。

1 材料與方法

1.1 小蠹蟲采集及形態(tài)鑒定

2019年8月1在江蘇省鹽城東臺(tái)林場(chǎng)(120°48′E，32°43′N)枯死楊樹中選擇有大量小蠹蟲蛀道的樹干，截取厚約為20 cm的圓盤置于泡沫盒中(425 mm ×300 mm×245 mm)，保存于南京林業(yè)大學(xué)江蘇省有害生物預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，待小蠹蟲羽化后收集該蟲并浸泡于75% 酒精溶液中，將其命名為JSYC-beetle，以備后續(xù)形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn)使用。

將采集的小蠹蟲置于SteREO Discovery V28蔡司體視顯微鏡(德國(guó)卡爾蔡司公司)下拍照，記錄小蠹蟲頭部、前足、前胸背板等主要形態(tài)特征，并對(duì)小蠹蟲鞘翅和前胸背板進(jìn)行形態(tài)測(cè)定，其中雌蟲測(cè)量20頭，雄蟲測(cè)量1頭，使用Photoshop CS 6.0對(duì)照片進(jìn)行處理。

1.2 小蠹蟲基因組DNA提取

采用CTAB法提取小蠹蟲基因組DNA[19]，主要步驟如下：①液氮研磨小蠹蟲至粉末狀，置于1.5 mL 離心管中，加入100 μL 2× CTAB，10 μL二硫蘇糖醇(DTT)和 4 μL的蛋白酶，浸沒小蠹蟲粉末；②渦旋混勻，65 ℃金屬浴裂解45 min；③加入等體積氯仿/異戊醇(體積比 24∶1)，12 000 r/min 離心 20 min；④取上清，加入 300 μL 冰凍異丙醇混勻，室溫條件下靜置 30 min；⑤12 000 r/min離心 30 min，棄上清液，70%(體積分?jǐn)?shù))酒精洗滌自然風(fēng)干后加20 μL去離子水溶解DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物序列

選取常用基因引物包括COI、28S rDNA以及CAD等對(duì)枯死楊樹內(nèi)小蠹蟲基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，具體引物堿基序列見表1[13]。

表1 COI、28S rDNA和 CAD引物序列Table 1 Primers sequence of COI，28S rDNA and CAD

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系50 μL：2 μL的正向引物，2 μL的反向引物，2 μL的模板，25 μL 2×PCR MIX和19 μL ddH20。其中COI擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃條件下延伸10 min。28SrDNA的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。CAD擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 電泳檢測(cè)

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，用1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物(電壓為80V，電泳時(shí)間為45 min)，GelRed 染色，置凝膠于302 nm 透射紫外燈上觀察、拍照。

1.6 序列比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹的制作

3個(gè)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送由上海生工生物工程公司測(cè)序。用DNAMAN 6.0軟件對(duì)每個(gè)基因正反向測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行拼接，得到完整序列。將得到的3個(gè)基因序列分別在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 相似性比對(duì)，查看相似性數(shù)據(jù)。使用MEGA 6軟件，以NJ法構(gòu)建小蠹蟲COI、28S rDNA和CAD的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中COI外群為Ipswoodi，28S rDNA和CAD的外群為Ipsacuminatus。

1.7 坡面方胸材小蠹在中國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)林業(yè)有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系[20-21]，依據(jù)坡面方胸材小蠹在國(guó)內(nèi)分布 (P1)，傳入、定殖和擴(kuò)散可能性(P2)，潛在危害(P3)，受害寄主經(jīng)濟(jì)重要性(P4)以及危險(xiǎn)性管理難度(P5)等5 個(gè)準(zhǔn)則層(Pi)分別對(duì)其評(píng)價(jià)賦分，由綜合評(píng)判公式最終確定其風(fēng)險(xiǎn)值(R)，綜合評(píng)判公式如下:

P1=P11;

P3=0.4×P31+0.4×P32+0.2×P33;

P4=max(P41,P42,P43);

P5=(P51+P52+P53)/3;

風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定按照:2.5 ≤R<3.0 為特別危險(xiǎn)，2.0 ≤R<2.5為高度危險(xiǎn)，1.5 ≤R<2.0 為中度危險(xiǎn)，1.0 ≤R<1.5 為低度危險(xiǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 坡面方胸材小蠹的形態(tài)鑒定

經(jīng)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)(表2，圖1)，雌蟲體色紅褐色至黑色(圖1)，體長(zhǎng)3.3～3.7 mm，寬1.49～1.64 mm(表2);雄蟲體色黃褐色(圖1)，體長(zhǎng)2.264 mm，寬1.195 mm。該小蠹蟲體金屬光澤強(qiáng)，觸角鞭節(jié)5節(jié)，第1節(jié)長(zhǎng)度小于其余各節(jié)，觸角末節(jié)球狀，有2條明顯的橫縫，復(fù)眼腎形，從小蠹蟲的背面看不到頭部，頭部無喙，前胸背板近方形狀，凸出明顯，前緣闊圓形，寬略大于長(zhǎng)，前半部分分布鱗狀齒，后半部分光滑。小盾片舌狀，鞘翅寬略大于前胸背板的寬度，鞘翅斜面從基部至端部逐漸傾斜，鞘翅輪廓如舌，鞘翅列間部上的刻點(diǎn)與溝內(nèi)刻點(diǎn)大小相近，分布均勻，鞘翅茸毛長(zhǎng)。前足脛節(jié)具有8～14個(gè)齒瘤不等，第1跗節(jié)小于其余跗節(jié)長(zhǎng)度之和，依據(jù)以上形態(tài)特征初定為坡面方胸材小蠹(圖1)。

表2 坡面方胸材小蠹形態(tài)指標(biāo)測(cè)量值Table 2 The measurement value of E. interjectus mm

A-C. 雄蟲male; D-F. 雌蟲female; A+D. 背面觀dorsal view; B+E. 側(cè)面觀lateral view; C+F. 腹面觀ventral view。圖1 坡面方胸材小蠹形態(tài)Fig.1 Optical photograph of E. interjectus

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以坡面方胸材小蠹基因組DNA為模版，分別對(duì)COI、28S rDNA和CAD基因進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明(圖2)，3對(duì)引物均能擴(kuò)增出單一、明亮條帶。其中COI基因擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的條帶大小為700～1 000 bp，28S rDNA基因擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的條帶大小約為500 bp,CAD基因擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的條帶大小為400～500 bp。

M. DL 1 000 DNA marker; 1. COI; 2. 28S rDNA; 3. CAD.圖2 坡面方胸材小蠹基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of E. interjectus gene

2.3 NCBI序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

經(jīng)NCBI 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，該小蠹蟲3個(gè)基因測(cè)序序列在NCBI基因庫(kù)中均與坡面方胸材小蠹E.interjectus相關(guān)基因的相似度最高(其中COI基因比對(duì)相似度為99.14%；28S rDNA 基因比對(duì)相似度為99.38%；CAD基因比對(duì)相似度為99.36%)?；贑OI、28S rDNA和CAD，采用NJ法構(gòu)建小蠹的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示：本試驗(yàn)收集的小蠹蟲JSYC-beetle 蟲株均與坡面方胸材小蠹(E.interjectus)聚在一個(gè)分支上(圖3)，進(jìn)一步確證形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，即本試驗(yàn)收集的小蠹蟲JSYC-beetle蟲株為坡面方胸材小蠹。

圖3 基于鄰接法構(gòu)建的坡面方胸材小蠹系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining tree of E. interjectus

2.4 坡面方胸材小蠹在中國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)分析

坡面方胸材小蠹在綜合評(píng)價(jià)賦分體系中的具體賦分值及賦分理由如表 3 所示。經(jīng)計(jì)算，各準(zhǔn)則層P1= 1.8，P2= 1.9，P3= 1.88，P4=2.5，P5=2.06，最終計(jì)算出風(fēng)險(xiǎn)值R=2.01，對(duì)照風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，坡面方胸材小蠹在中國(guó)流行風(fēng)險(xiǎn)性較高，需加強(qiáng)檢疫。

表3 坡面方胸材小蠹多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)體系Table 3 The index layer evaluation of integrated multi index evaluation system for E. interjectus

3 討 論

小蠹蟲是一類重要的蛀干害蟲，根據(jù)其食性可分為樹皮小蠹和食菌小蠹。方胸材小蠹是唯一能培養(yǎng)真菌的食菌小蠹，是食菌小蠹蟲中典型代表，方胸材小蠹可幫助鐮刀菌擴(kuò)散和繁殖，而小蠹培養(yǎng)的鐮刀菌則可作為幼蟲和成蟲的食物資源，兩者之間形成強(qiáng)烈的共生關(guān)系，稱之為鐮刀菌-方胸材小蠹共生體(Fusarium-Euwallaceamutualism)[22]。雖然鐮刀菌為弱寄生菌，但是可以在多種植物上引起植物枯萎病[23-25]，已有文獻(xiàn)報(bào)道小圓方胸小蠹和小圓方胸小蠹近似種(Euwallaceanr.fornicatus)攜帶的鐮刀菌在Platanus×acerifolia和Perseaamericana上引起嚴(yán)重枯萎病[26-27]，但前提是需要攜帶鐮刀菌的小蠹蟲入侵寄主植物。此外，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)坡面方胸材小蠹可以攜帶無花果角孢菌(Ceratocystisficicola)，該病原物可以引發(fā)無花果樹(Ficuscarica)產(chǎn)生一種系統(tǒng)性病害無花果潰瘍病，由于前期對(duì)無花果潰瘍病的流行規(guī)律認(rèn)識(shí)不足，導(dǎo)致該病害已在日本果園廣泛存在，對(duì)當(dāng)?shù)氐墓麍@造成重大經(jīng)濟(jì)損失[28]。因此在日本坡面方胸材小蠹被認(rèn)為是果園中的一種毀滅性害蟲，至今沒有良好的防控措施。

方胸材小蠹屬昆蟲一直被認(rèn)為是次期性害蟲，不會(huì)危害健康寄主植物，但隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)方胸材小蠹屬昆蟲也可能危害健康寄主植物[22]。2019年，在阿根廷報(bào)道種植美洲黑楊(Populusdeltoides)上發(fā)現(xiàn)坡面方胸材小蠹，該研究同時(shí)指出坡面方胸材小蠹可以危害健康寄主[6]。而本次試驗(yàn)所鑒定的坡面方胸材小蠹從江蘇東臺(tái)枯死楊樹中收集，林場(chǎng)內(nèi)出現(xiàn)大量的楊樹死亡，推測(cè)可能是由坡面方胸材小蠹以及攜帶的病原微生物所致。楊樹作為我國(guó)主要的材用樹種，因生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)，在我國(guó)大面積種植，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值[29]。坡面方胸材小蠹雖曾多次在調(diào)運(yùn)木材發(fā)現(xiàn)，但未被列入檢疫名單，而且該小蠹蟲體積小，寄生在寄主植物體內(nèi)，因此在檢疫和防治工作中容易被忽略。若坡面方胸材小蠹可以直接危害健康楊樹，則會(huì)對(duì)北方楊樹安全構(gòu)成威脅。對(duì)坡面材小蠹在中國(guó)風(fēng)險(xiǎn)分析表明，該生物在中國(guó)屬于高危物種，需要加強(qiáng)檢疫。

坡面方胸材小蠹目前在國(guó)內(nèi)雖有，但尚未爆發(fā)成災(zāi)，因此國(guó)內(nèi)對(duì)坡面方胸材小蠹研究較少。本研究以坡面方胸材小蠹為材料，通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)該小蠹進(jìn)行鑒定，為將來防治坡面方胸材小蠹提供支持，但對(duì)于坡面方胸材小蠹的具體防治措施還需要建立在小蠹蟲生活習(xí)性、危害特征以及傳播規(guī)律的基礎(chǔ)之上，因此還需要對(duì)坡面方胸材小蠹進(jìn)行深入研究。