白樺BpGRAS1基因的克隆及耐鹽功能分析

張 群，及曉宇，賀子航，王智博，田增智，王 超

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040)

鹽脅迫是不利于植物生長和發(fā)育的主要非生物脅迫之一，處于逆境中的植物其生長發(fā)育會受到不同程度的影響，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致植物死亡。為了減少這些條件的不利影響，植物已經(jīng)進(jìn)化出多方面的策略，包括形態(tài)、生理和生化適應(yīng)。在對各種非生物脅迫的響應(yīng)和適應(yīng)過程中，誘導(dǎo)了許多與脅迫相關(guān)的基因，并且積累了多種與脅迫抗性相關(guān)的功能蛋白[1]。因此，了解鹽脅迫響應(yīng)的生物分子基礎(chǔ)和耐受機(jī)制對于植物耐鹽和基因工程育種非常重要[2]。

GRAS蛋白是植物轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)的一個重要家族，GRAS 家族的名字源于3個最初發(fā)現(xiàn)分離出來的成員 GAI [GA (GIBBERELLIC ACID)INSENSITIVE]、RGA(REPRESSOROFGAI)和SCR(SCARECROW)[3]。GRAS在調(diào)控植物生長、發(fā)育和脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。該蛋白一般由400～800個氨基酸殘基組成，其C端高度保守，N端為高度變異區(qū)，該蛋白家族的成員具有其特有的GRAS 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)與植物的抗逆機(jī)制有著密切的聯(lián)系，其中部分成員還具有 DELLA 蛋白結(jié)構(gòu)[4]。DELLA蛋白不僅是縱向根系生長抑制因子，而且還是皮層徑向細(xì)胞擴(kuò)張的積極調(diào)節(jié)因子[5]，在調(diào)控植物根冠發(fā)育中發(fā)揮著極其重要的作用，可以提高植物對非生物脅迫的抗性[6]。研究表明，GRAS轉(zhuǎn)錄因子參與了植物生長發(fā)育及形態(tài)建成(如赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]、根的發(fā)育[8]、分生組織的形成[9])，以及植物抗病性[10]和非生物脅迫反應(yīng)[11]。

近些年來陸續(xù)有不同植物種的GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族被鑒定出來，GRAS家族全基因組分析顯示：梅花(Armeniacamume)中有46個GRAS基因[12]，白菜(Brassicapekinensis)中有48個[13]，楊樹(Populusspp.)中有106個[14]，葡萄(Vitisvinifera)中有52個[11];甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)基因組中87個GRAS基因分屬13個亞家族，有24個BnGRAS基因在根部高特異性表達(dá)[15];番茄(Lycopersiconesculentum)中有53個GRAS家族成員[16];水稻(Oryzasativa)中至少有57個GRAS基因[17];SHR也是一種GRAS轉(zhuǎn)錄因子，在毛果楊(Populustrichocarpa)中鑒定出3個SHR樣基因[18]，在茶樹(Camelliasinensis)中鑒定出52個編碼GRAS蛋白的CsGRAS基因[19]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了多種非生物脅迫應(yīng)答的GRAS轉(zhuǎn)錄因子。

此外，通過各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了GRAS轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆方面的調(diào)控作用。BrLAS編碼一種干旱反應(yīng)型GRAS轉(zhuǎn)錄因子，BrLAS主要參與ABA介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，其過表達(dá)的擬南芥(Arabidopsisthaliana)在營養(yǎng)生長期和生殖生長期表現(xiàn)出對外源ABA的超敏和多效性，對植物的耐旱性有積極的調(diào)節(jié)作用[20]。山葡萄(Vitisamurensis)PAT1作為一個受脅迫誘導(dǎo)的GRAS基因，通過調(diào)控一系列抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)了過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒、耐旱和耐鹽能力[21]。OsGRAS23過表達(dá)水稻表現(xiàn)出極高的抗旱性和抗氧化性[17]。SlGRAS40能夠調(diào)控西紅柿的抗旱、耐鹽能力，通過調(diào)節(jié)葉片的氣孔縮小，從而保留了更多的水分[22]。JrGRAS能夠特異性結(jié)合Dof元件，以改善JrGRAS的高溫應(yīng)激反應(yīng)，在一定程度上控制了HSPs的表達(dá)，提高核桃耐高溫能力[23]。GRAS基因在鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)的不同組織中廣泛分布并表達(dá)，通過鑒定發(fā)現(xiàn)有8個基因經(jīng)受高溫和鹽脅迫后在不同組織中表達(dá)上調(diào)[24]。利用大麥條紋花葉病毒(BSMV)誘導(dǎo)小麥(Triticumaestivum)TaSCL14基因沉默(VIGS)，發(fā)現(xiàn)TaSCL14的沉默導(dǎo)致植株生長受到抑制，光合能力下降，對光氧化脅迫的耐受性降低[25]。以上研究僅僅鑒定出GRAS對非生物脅迫有響應(yīng)，對其抗逆調(diào)控機(jī)制研究較少。在擬南芥、水稻的全基因組分析較為透徹，且多為某一亞族分支的相關(guān)性研究為主。

白樺(Betulaplatyphylla) 在我國東北地區(qū)廣泛分布，因其對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長迅速，具有重要的生態(tài)、觀賞和應(yīng)用價值等特點(diǎn)被列為國家科技計(jì)劃研究的重要樹種之一，因此研究其響應(yīng)非生物脅迫的生物分子基礎(chǔ)和耐受機(jī)制具有重要意義[26]。目前，關(guān)于白樺響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制及耐鹽白樺分子育種開展了一些研究，BpmiR156基因過表達(dá)白樺株系與對照株系相比,在鹽脅迫后鹽害指數(shù)增加、生長速度變慢、膜系統(tǒng)損傷更嚴(yán)重,在一定程度上降低了白樺的耐鹽性[27]。而外源TabZIP的表達(dá)能夠提高TB4轉(zhuǎn)基因白樺株系的耐鹽能力[28]。張宇等[29]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BpMYB4 能使白樺超氧比物歧化酶(SOD)的活性增加，消除植株體內(nèi)新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，進(jìn)而提高白樺抵御低溫的能力。關(guān)于白樺GRAS家族全面的生物信息學(xué)分析以及逆境脅迫相關(guān)性研究還鮮見報(bào)道。本研究通過白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出一條響應(yīng)鹽脅迫的GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因，將其命名為BpGRAS1。對BpGRAS1在鹽脅迫下的表達(dá)水平及其耐鹽功能進(jìn)行分析，以期為研究木本植物中GRAS轉(zhuǎn)錄因子的抗逆分子機(jī)制提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白樺無性系組培苗由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。組培苗培養(yǎng)條件：溫度為25 ℃，光周期為12 h光照/12 h黑暗。

大腸桿菌(Escherichiacoli) Top10、根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens) EHA105、植物表達(dá)載體pROKⅡ、pFGC5941 由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 BpGRAS1基因的克隆

取4周苗齡白樺幼苗，使用植物總RNA提取試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司，北京)提取白樺的總RNA，并利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMIX(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第 1 鏈 cDNA，作為模板為后續(xù)實(shí)驗(yàn)備用[30]。

通過白樺鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選獲得1條差異表達(dá)的GRAS基因，命名為BpGRAS1(GenBank number: MN117546.1)。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物BpGRAS1-F 和BpGRAS1-R(表1)，以白樺cDNA為模板克隆BpGRAS1基因。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站，獲得8個不同物種的GRAS序列數(shù)據(jù)，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對分析。將6條輻射松(Pinusradiata)GRAS蛋白序列、20條毛果楊GRAS蛋白序列、在Tair (https://www.arabidopsis.org/) 網(wǎng)站上獲得的擬南芥32條 GRAS 家族序列數(shù)據(jù)與白樺基因組中獲得的40條白樺GRAS家族蛋白序列，用 MEGA6. 0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 pROKⅡ-BpGRAS1過表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)BpGRAS1序列分別設(shè)計(jì)引物pROKⅡ-BpGRAS1-F和pROKⅡ-BpGRAS1-R(表1)，引入XbaI 和KpnI 酶切位點(diǎn)，以白樺 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，用XbaI和KpnI 對pROKⅡ質(zhì)粒和純化的BpGRAS1基因進(jìn)行雙酶切，將BpGRAS1連接到pROKⅡ載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以單克隆菌落為模板，使用pROKⅡ載體引物進(jìn)行菌落PCR，挑取條帶長度正確的菌落搖菌并進(jìn)行測序驗(yàn)證。提取測序正確的重組pROKⅡ-BpGRAS1載體質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化為農(nóng)桿菌 EHA105 感受態(tài)，保存菌種備用。

1.5 pFGC5941-BpGRAS1抑制表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)BpGRAS1序列分別引入NcoI 和AscI 酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物 pFGC5941-BpGRAS1-cis-F 和 pFGC5941-BpGRAS1-cis-R (表1)，以白樺 cDNA 為模板，通過PCR 擴(kuò)增獲得BpGRAS1 cis端干擾片段，利用NcoI和AscI對 pFGC5941 載體質(zhì)粒以及純化后的BpGRAS1基因片段進(jìn)行雙酶切，將BpGRAS1cis端干擾片段正向連接到線性化的pFGC5941 載體上。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得單克隆菌落，以單克隆菌落為模板，使用cis端載體引物進(jìn)行菌落PCR檢測。將條帶長度正確的菌落搖菌送測序，經(jīng)測序比對正確后提取重組載體質(zhì)粒，將其命名為 pFGC5941-BpGRAS1-cis。通過引入XbaI 和BamHI 酶切位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)引物 pFGC5941-BpGRAS1-anti-F 和 pFGC5941-BpGRAS1-anti-R。依照上述方法將BpGRAS1anti端干擾片段反向構(gòu)建到 pFGC5941-BpGRAS1-cis 載體上。測序驗(yàn)證重組載體質(zhì)粒，并命名為 pFGC5941-BpGRAS1，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA105 感受態(tài)，保存菌種備用[30]。

1.6 BpGRAS1基因瞬時表達(dá)白樺的獲得及脅迫處理

將pROKⅡ-BpGRAS1-EHA105、pFGC5941-BpGRAS1-EHA105 和 pROKⅡ-EHA105 按照農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[31]瞬時侵染培養(yǎng)4周大小的白樺組培苗，獲得BpGRAS1基因瞬時過表達(dá)(OE)、抑制表達(dá)(IE) 及轉(zhuǎn)空載體對照(WT) 植株。BpGRAS1基因瞬時過表達(dá)、抑制表達(dá)及對照白樺植株在1/2 MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，將部分植株移至含有 150 mmol/L NaCl 的 1/2 MS 培養(yǎng)基中再進(jìn)行脅迫處理 24 h。

1.7 BpGRAS1基因瞬時轉(zhuǎn)化白樺植株的實(shí)時熒光定量PCR檢測

為驗(yàn)證BpGRAS1基因在瞬時表達(dá)白樺植株中的表達(dá)情況，分別提取鹽脅迫及非脅迫下過表達(dá)、抑制表達(dá)及對照白樺植株的總RNA(同生理指標(biāo)分析為同一批材料)，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，每20 μL體積反應(yīng)混合物包括10 μL SYBR Green實(shí)時PCR預(yù)混液(Toyobo，日本)，2 μL cDNA模板(100 ng)和0.5 μL特異性引物(10 μmol/L)。使用以下反應(yīng)步驟進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性94 ℃ 30 s，然后再變性94 ℃ 12 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s進(jìn)行45個循環(huán)，82 ℃讀板1 s。使用qTOWER3PCR儀(Analytik Jena AG，德國耶拿)進(jìn)行qRT-PCR，選取白樺Actin和β-tubulin為內(nèi)參基因[32]，引物序列見表1，進(jìn)行了3次獨(dú)立的試驗(yàn)?；虮磉_(dá)量分析采用2-△△Ct法[33]。

1.8 BpGRAS1基因瞬時表達(dá)白樺的抗逆生理指標(biāo)分析

分別測定鹽脅迫處理(150 mmol/L)及水處理(對照)中過表達(dá)、抑制表達(dá)及轉(zhuǎn)空載體對照各植株內(nèi)的電解質(zhì)滲透率、失水率(分別在鹽脅迫處理24 h結(jié)束后測定0. 5、1、1. 5、2、3、4 h 時的失水率)、丙二醛(MDA)含量、過氧化物酶(POD) 及超氧化物歧化酶(SOD) 活性，測定方法與算法詳見文獻(xiàn)[34]。每種測定每種處理3次重復(fù)，每次重復(fù)3棵植株。

1.9 數(shù)據(jù)處理

為避免試驗(yàn)誤差，保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)用SPSS 21.0進(jìn)行分析處理，采用Tukey法[34]來判斷差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpGRAS1保守序列鑒定及其系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究前期分別以鹽脅迫及水澆灌處理不同時間(3、6、12、24和48 h)白樺為材料構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組，經(jīng)DEG分析，獲得了17個響應(yīng)鹽脅迫的GRAS轉(zhuǎn)錄因子，選擇其中表達(dá)差異最顯著的基因BpGRAS1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。BpGRAS1基因的開放閱讀框?yàn)? 425 bp，編碼474個氨基酸。在NCBI網(wǎng)站上對BpGRAS1cDNA編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)該序列與川黔千金榆(Carpinusfangiana)的相似性最高，為87.31%。對BpGRAS1與其他8個物種的 GRAS 蛋白相似性進(jìn)行保守序列分析，結(jié)果顯示：BpGRAS1具有GRAS家族的序列特征，在C端的氨基酸序列相似度較高(圖1)。由40條白樺GRAS蛋白與32條擬南芥GRAS蛋白、6條輻射松GRAS蛋白、20條毛果楊GRAS蛋白構(gòu)成的進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，可分為8個亞家族，BpGRAS1與AtSHR蛋白質(zhì)序列親緣關(guān)系較近，同屬于Ⅳ亞家族(圖2)。

JrGRAS.胡桃Juglans regia(XP_018813105.1)；PaGRAS.歐洲甜櫻桃Prunus avium(XP_021825482.1)；CfGRAS.川黔千金榆Carpinus fangiana(KAE8076562.1); ZjGRAS.棗Ziziphus jujuba(XP_015886865.1)；QsGRAS.歐洲栓皮櫟Quercus suber (XP_023909161.1)；MdGRAS.蘋果Malus domestica(XP_008369183.2); HuGRAS.哥倫比亞錦葵Herrania umbratica (XP_021290978.1)；EgGRAS.大葉桉Eucalyptus grandis (XP_010047409.1)。圖1 不同物種GRAS蛋白多序列比對Fig.1 Multiple alignment of GRAS proteins from different species

圖2 GRAS系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of GRAS

2.2 瞬時轉(zhuǎn)化植株的獲得

對植物表達(dá)載體pROKⅡ-BpGRAS1進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示目標(biāo)條帶正確擴(kuò)增，載體構(gòu)建成功(圖3A)。對植物表達(dá)載體pFGC5941-BpGRAS1進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，抑制表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖3B)。最終通過測序分析比對，分別保存菌種備用。

A: M. DL5000 Marker; 1. pROKⅡ載體引物單菌落PCR產(chǎn)物 PCR product of pROKⅡ vector primer single colony; 2. 基因引物巢式PCR產(chǎn)物PCR product of gene primer nested. B: M. DL2000 Marker; 1. pFGC5941cis端載體引物單菌落PCR產(chǎn)物PCR product of pFGC5941 cis end vector primer single colony; 2. cis端基因引物巢式PCR產(chǎn)物Nested PCR products of cis end gene primer。 圖3 植物表達(dá)載體pROKⅡ-BpGRAS1及pFGC5941- BpGRAS1的構(gòu)建Fig.3 Construction of plant expression vector pROKⅡ-BpGRAS1 and pFGC5941- BpGRAS1

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng),獲得BpGRAS1基因瞬時過表達(dá)(OE)、抑制表達(dá)(IE) 及對照(WT) 植株。

2.3 BpGRAS1基因瞬時轉(zhuǎn)化白樺植株的實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果

對3種植株進(jìn)行鹽脅迫處理后，實(shí)時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，在正常條件下，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中BpGRAS1的表達(dá)量最高，抑制表達(dá)植株中表達(dá)量最低。鹽脅迫處理后，pROKⅡ-BpGRAS1-EHA105植株表達(dá)量最高，pFGC5941-BpGRAS1-EHA105表達(dá)量最低，并且過表達(dá)植株中的表達(dá)量高于非脅迫處理，抑制表達(dá)植株中的表達(dá)量低于對照(圖4)。以上結(jié)果證實(shí)已經(jīng)獲得了BpGRAS1過表達(dá)和抑制表達(dá)瞬時轉(zhuǎn)化白樺植株，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

*.P<0.05。下同。The same below.圖4 BpGRAS1基因瞬時轉(zhuǎn)化白樺植株qRT-PCR檢測Fig.4 qRT-PCR detection of B. platyphylla transiently transformed with BpGRAS1 gene

2.4 BpGRAS1基因瞬時表達(dá)及對照白樺植株電解質(zhì)滲透率、失水率及丙二醛含量分析

對轉(zhuǎn)化植株及野生型對照鹽脅迫下的電解質(zhì)滲透率測定結(jié)果表明：非脅迫條件下，OE、IE和WT植株的相對電導(dǎo)率基本一致；鹽脅迫處理后，WT及IE植株的相對電導(dǎo)率數(shù)值顯著高于OE植株，且IE植株的電解質(zhì)滲透率數(shù)值最高。該結(jié)果說明在白樺中過表達(dá)BpGRAS1基因可以降低白樺在鹽脅迫下的電解質(zhì)滲透率，從而保護(hù)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性(圖5A)。

圖5 鹽脅迫下瞬時過表達(dá)、抑制表達(dá)及對照白樺植株電解質(zhì)滲透率、失水率及MDA含量分析Fig.5 Analysis of electrolyte permeability, water loss rate and MDA content of B. platyphylla plant transiently OE, IE and WT under salt stress

瞬時表達(dá)以及對照組白樺葉片(3次重復(fù))失水率測定結(jié)果顯示：在0.5 h之內(nèi)抑制表達(dá)的失水率高于對照組及過表達(dá)植株；在1～3 h內(nèi)，抑制表達(dá)植株與對照組白樺的失水率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于過表達(dá)植株的失水率；在3～4 h內(nèi)，過表達(dá)植株的失水率仍最低。結(jié)果表明，BpGRAS1基因的過表達(dá)可以降低植物在鹽脅迫下的失水率，從而增加白樺的抗逆功能(圖5B)。

OE、IE以及WT白樺葉片(3次重復(fù))MDA含量測定結(jié)果顯示：1/2 MS培養(yǎng)條件下，OE、IE植株和WT白樺植株的MDA含量基本一致；但在鹽脅迫條件下，OE植株的 MDA 含量為最低，IE植株的MDA 含量最高。由此說明BpGRAS1基因的過表達(dá)可以顯著降低白樺在鹽脅迫條件下 MDA 含量的積累，進(jìn)而增強(qiáng)其抗逆能力(圖5C)。

2.5 BpGRAS1基因瞬時表達(dá)及對照白樺植株P(guān)OD、SOD酶活分析

對轉(zhuǎn)化植株及野生型對照鹽脅迫下的POD及SOD酶活性測定結(jié)果(圖6)表明，在正常生長條件下，BpGRAS1基因過表達(dá)及對照植株的 POD 活性略高于抑制表達(dá)植株的POD值；在鹽脅迫條件下，BpGRAS1基因過表達(dá)植株的 POD活性明顯高于對照及抑制表達(dá)植株。同樣在鹽脅迫條件下，OE植株的 SOD的活性明顯高于WT及IE植株。該結(jié)果表明BpGRAS1基因的過表達(dá)增強(qiáng)了 POD 和 SOD 的活性，增強(qiáng)其清除溶液中產(chǎn)生的過氧自由活性基團(tuán)的能力，進(jìn)而提高了白樺的耐鹽能力。

圖6 鹽脅迫下瞬時OE、IE及WT白樺植株P(guān)OD、SOD活性分析Fig.6 Analysis of POD and SOD activities in transient OE, IE and WT B. platyphylla under salt stress

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗非生物脅迫中具有重要作用，發(fā)掘抗非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，研究其抗逆分子機(jī)制，能夠?yàn)榱帜究鼓娣肿痈牧继峁┲匾獢?shù)據(jù)和材料。已有研究顯示，GRAS轉(zhuǎn)錄因子參與植物抵抗非生物脅迫[17,20-24]。本研究前期，在白樺鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，GRAS基因響應(yīng)鹽脅迫的誘導(dǎo)，從中篩選上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最高的1條GRAS基因，對其進(jìn)行克隆，命名為BpGRAS1。利用生物信息學(xué)工具將其與其他8種植物的GRAS蛋白進(jìn)行多序列比對，多序列比對結(jié)果顯示：BpGRAS1在C端的氨基酸序列相似度比較高，具有GRAS家族的序列特征[35]，說明該保守區(qū)對GRAS基因家族功能具有重要作用。為了進(jìn)一步分析該基因的潛在抗逆功能，將其蛋白序列與擬南芥32個GRAS蛋白、6個輻射松GRAS蛋白、20個毛果楊GRAS蛋白以及40個白樺GRAS蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，BpGRAS1與AtSHR蛋白親緣關(guān)系較近，同屬于Ⅳ亞家族。Yuan[36]研究發(fā)現(xiàn)SHR在鹽誘導(dǎo)的幼苗發(fā)育抑制中發(fā)揮重要作用。因此推測BpGRAS1在白樺中具有一定的耐鹽功能。

為了驗(yàn)證BpGRAS1基因耐鹽功能，分析耐鹽響應(yīng)的生理生化變化，分別構(gòu)建植物過表達(dá)(pROKⅡ-BpGRAS1) 及抑制表達(dá)(pFGC5941-BpGRAS1) 載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效瞬時遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得了BpGRAS1基因瞬時OE、IE及WT白樺植株。qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn):BpGRAS1基因的表達(dá)量在OE植株中顯著上升，在IE植株中顯著下降，證明在上述試驗(yàn)中獲得的瞬時表達(dá)白樺植株可用于后續(xù)抗逆功能獲得或缺失的研究。

細(xì)胞膜對維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常的代謝起著重要的作用。植物組織在受到各種非生物脅迫時，細(xì)胞膜透性增大，電解質(zhì)外滲，因此電解質(zhì)滲透率是判定細(xì)胞受損的一個重要生理指標(biāo)[37]。在逆境生長條件下失水率是衡量植物抗逆能力的重要的生理指標(biāo)之一，植物抗逆能力越強(qiáng)，失水率越低[38]。在植物衰老生理和抗性生理研究中丙二醛 (MDA) 含量是一個常用指標(biāo)。在經(jīng)歷衰老、凋亡或逆境條件下，植物通常發(fā)生膜脂過氧化作用，其最終分解產(chǎn)物MDA含量越高說明植物所遭受逆境傷害越大[39]。為此，本研究分別對脅迫條件下BpGRAS1基因過表達(dá)、抑制表達(dá)及對照白樺植株的抗逆生理指標(biāo)進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，過表達(dá)BpGRAS1基因可以降低白樺在鹽脅迫下的電解質(zhì)滲透率、失水率及MDA含量，說明BpGRAS1基因能夠保護(hù)細(xì)胞膜，避免膜損傷，具有一定的抗非生物脅迫功能。

研究表明VaPAT1、SlGRAS40等基因的表達(dá)能夠通過提高保護(hù)酶活性增強(qiáng)植物對干旱和鹽的抗性[21-22]。為了分析BpGRAS1基因提高轉(zhuǎn)基因白樺耐鹽性的作用機(jī)制，對鹽脅迫下OE、IE及WT植株的POD、SOD 酶活性進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株的POD、SOD 活性顯著高于對照和抑制表達(dá)植株。由此推斷鹽脅迫后BpGRAS1基因的表達(dá)能夠調(diào)控與POD、SOD 相關(guān)基因的表達(dá)，通過增加 POD 和 SOD 的活性進(jìn)而提高白樺的耐鹽能力。

綜上所述，本研究利用PCR技術(shù)克隆白樺BpGRAS1基因，其開放閱讀框?yàn)? 425 bp，編碼474個氨基酸。BpGRAS1轉(zhuǎn)錄因子具有 1 個保守的C端 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并具有GRAS家族的序列特征。BpGRAS1與AtSHR 蛋白的親緣關(guān)系較近，同屬于Ⅳ亞家族。鹽脅迫下過表達(dá)BpGRAS1基因通過增強(qiáng) POD 和 SOD 活性減少細(xì)胞受損或死亡，從而提高白樺的耐鹽能力。在后續(xù)的研究中，將對BpGRAS1調(diào)控的靶基因及靶基因調(diào)控的抗逆生理學(xué)途徑進(jìn)行系統(tǒng)的研究，擬為研究白樺GRAS轉(zhuǎn)錄因子的抗逆調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。