基于葉綠體基因trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的甘薯種質遺傳多樣性分析

王崇 焦春海 楊新筍 張文英 雷劍 柴沙沙 王連軍 田小海

摘要：【目的】利用葉綠體基因組（cpDNA）的間隔區(qū)序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）對甘薯種質進行遺傳多樣性分析，為其種質保護及開發(fā)利用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳詮奈覈?2個省份收集的52份甘薯種質為材料，從10個cpDNA間隔區(qū)序列的引物中篩選出能擴增單一、清晰明亮且穩(wěn)定的序列引物，利用其PCR擴增篩選出間隔區(qū)序列，并進行測序及序列拼接。利用DnaSP 5.0進行序列特征分析，采用MEGA X計算52份甘薯種質材料的遺傳距離，并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。【結果】篩選獲得7對擴增結果較理想的引物，其PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序分析，共獲得3個有效標記（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）。三者的拼接序列長度為2239 bp，共有7個變異位點，2個單一突變位點，5個簡約信息位點，11個插入/缺失位點。在52份甘薯種質材料中，trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的變異位點數(shù)量（Vs）分別為1、1和5個，單倍型數(shù)目（H）分別為2、4和5個，拼接序列的單倍型數(shù)目為10個;核苷酸多樣性（π）和單倍型多樣性（Hd）最高的序列分別為trnT-trnL（π=0.00052）和trnH-psbA（Hd=0.535）。trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的Tajimas D、Fu and Lis D*和Fu and Lis F*均無顯著差異（P>0.05），符合中性進化模式。基于拼接序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，52份甘薯種質材料的遺傳距離為0～1.1848，平均遺傳距離0.1018，其分為五大類，其中第Ⅰ類～Ⅳ類僅含有少量種質，其余41份種質歸為第Ⅴ類?！窘Y論】52份甘薯種質材料的遺傳變異較為豐富，但種質材料間的遺傳多樣性低，與cpDNA特性和甘薯遺傳背景狹窄有關。基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL的拼接序列更能準確分析甘薯種質的遺傳多樣性，且有效劃分不同類群，為甘薯集團育種提供候選材料。

關鍵詞： 甘薯;葉綠體基因組（cpDNA）;trnL-trnF;trnH-psbA;trnT-trnL;遺傳多樣性;系統(tǒng)發(fā)育進化樹

Abstract：【Objective】Genetic diversity of sweet potato germplasm was analyzed based on chloroplast genome DNA spacer sequences（trnL-trnF， trnH-psbA and trnT-trnL），to provide theoretical basis for the protection，development and utilization of sweet potato germplasm. 【Method】Taking 52 sweet potato materials from 12 different regions in China as the research object. From 10 primers of cpDNA spacer sequence， single， clear， bright and stable sequence primers were selected， and the selected spacer sequences were amplified by PCR， and sequenced and sequence spliced. The sequence features were analyzed by DnaSP 5.0 software. Using MEGA X software to calculate the genetic distance of 52 sweet potato germplasms and build phylogenetic tree. 【Result】Seven pairs of primers with ideal amplification results were screened. The PCR amplified products were sequenced and analyzed， and a total of three effective markers（trnL-trnF，trnH-psbA and trnT-trnL） were obtained. The splicing sequence length of the three was 2239 bp， which contained 7 mutation sites，2 singleton variable sites，5 parsimony information sites，and 11 insertion/deletion sites. Among the 52 sweet potato materials，the number of variable sites（Vs） of? trnL-trnF，trnH-psbA，and trnT-trnL sequences were 1，1 and 5，respectively. The number of haplotypes（H） for the three were 2，4 and 5，respectively. The number of haplotypes were 10 after three sequences being merged. The sequences with the highest nucleotide diversity（π） and haplotype diversity（Hd） were trnT-trnL（π=0.00052） and trnH-psbA（Hd=0.535）. Tajimas D and Fu and Lis D*， Fu and Lis F* values of trnL-trnF，trnH-psbA and trnT-trnL sequences did not reached the level of significant difference（P>0.05），respectively，which indicated that variation of those chloroplast regions followed neutral theory of molecular evolution. Phylogenetic tree constructed based on combination sequences showed that genetic distance of 52 sweet potato varieties was 0-1.1848，and the average genetic distance was 0.1018. The combination sequences divided the test sweet potato varieties into 5 categories.There are only a small amount of germplasms in Type I to Type IV， and the remaining 41 germplasms were classified as Type V. 【Conclusion】The genetic variation of 52 sweet potato germplasm materials is relatively rich， but the genetic diversity among germplasm materials is low， which is related to the cpDNA characteristics and the narrow genetic background of sweet potato. The trnL-trnF，trnH-psbA and trnT-trnL combination sequences can be used for sweet potato genetic diversity analysis，and the combination of the three sequences can distinguish the test materials into different groups and provide candidate materials for the next group breeding.

Key words： Ipomoea batatas（L.）Lam.; chloroplast genome（cpDNA）; trnL-trnF; trnH-psbA; trnT-trnL; genetic diversity; phylogenetic tree

0 引言

【研究意義】甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]為旋花科（Convolvulaceae）番薯屬（Ipomoea）雙子葉植物，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟效益，是全球第七大重要糧食作物、中國第五大重要糧食作物（Mohanraj and Sivasankar，2014;Shekhar et al.，2015;Wang et al.，2016;Drapal et al.，2019）。甘薯是同源六倍體（2n=6x=90），染色體數(shù)目多，遺傳背景復雜，給甘薯品種選育帶來了巨大挑戰(zhàn)（Yang et al.，2017a）。我國的甘薯種質資源豐富，但遺傳背景狹窄，親緣關系近，育成品種之間的血緣關系較近，接近94%甘薯品種具有南瑞苕和勝利百號的血緣，亟需拓寬甘薯的遺傳背景及種質資源的收集保護（李強等，2008;王連軍等，2018）。甘薯是無性繁殖作物，其主要育種手段是集團雜交。植物細胞質遺傳是集團雜交育種的基礎，其與葉綠體基因組（Chloroplast DNA，cpDNA）和線粒體基因組（Mitochondrial DNA，mt-DNA）密切有關（王連軍等，2015）。cpDNA大多數(shù)編碼蛋白除參與植物光合作用外，還參與其他的生化過程，如淀粉合成、色素合成和氮代謝，以及免疫反應等（Dunn et al.，2008;Ma et al.，2013;Martin et al.，2013）。cpDNA是植物體內(nèi)的三大遺傳系統(tǒng)之一，與核基因組相比，cpDNA具有分子量小、序列保守、進化緩慢、結構簡單和單親遺傳等特點，且不易受外界環(huán)境的干擾（高連明等，2012）。因此，基于cpDNA分子水平進行甘薯品種鑒定和遺傳多樣性分析，對于甘薯的種質資源開發(fā)、鑒定和保護具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】基于cpDNA序列的特性，可將其用于物種的分子圖譜構建、特定基因序列分析、物種鑒定、群體遺傳學研究以及系統(tǒng)進化分析（王化坤等，2006）。目前已利用cpDNA序列對梨（常耀軍等，2014;齊丹等，2019）、水稻（劉莎等，2017）、李（章秋平等，2017）等作物進行遺傳多樣性、系統(tǒng)進化和親緣關系分析。trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列分別是cpDNA的非編碼區(qū)，其進化速率快，片段兩端存在保守序列，具有易于設計通用引物、穩(wěn)定性好等特點，已在白楊（崔彬彬等，2006）、蘋果（朱元娣等，2014）、茶樹（劉振等，2018）、蒙古沙冬青（沈奇等，2019）、草莓（楊俊譽等，2020）等作物的分子鑒定和親緣關系分析中廣泛應用。吳小培等（2016）利用trnL-trnF序列對7份青藏扁蓿豆種質和3份內(nèi)蒙古扁蓿豆種質進行遺傳多樣性和群體結構分析，結果表明群體間存在一定程度的歷史基因交流，遺傳多樣性與氣候環(huán)境密切相關。Fragoso-Martínez等（2017）使用ITS、trnL-trnF和psbA-trnH序列對鼠尾草進行分子鑒定，共鑒定出17個鼠尾草亞類，并從側面驗證了南美洲鼠尾草的多起源學說。Yang等（2017b）利用多個cpDNA間隔區(qū)序列對中國橡木進行進化分析和親緣關系鑒定，結果發(fā)現(xiàn)psbA-trnH等序列對中國橡木具有較好的鑒別能力。許子欣等（2018）利用ITS序列和psbA-trnH序列對巴戟天居群進行分析，結果顯示巴戟天的遺傳結構與地理分布存在相關性。Appelhans和Wen（2020）研究發(fā)現(xiàn)，ITS和trnL-trnF序列結合可準確分析蕓香的起源和進化關系。【本研究切入點】目前基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列對甘薯種質進行遺傳多樣性及親緣關系分析的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】從我國12個省收集的52份甘薯種質為材料，PCR擴增其cpDNA間隔區(qū)序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL等），雙向測序后再拼接序列，基于合并序列進行遺傳多樣性及親緣關系分析，為甘薯種質保護和親本選配提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試甘薯種質材料52份，包括湖北省6份，江蘇省10份，安徽省5份，山東省6份，河北省4份，河南省5份，浙江省5份，四川省3份，廣東省3份，湖南省2份，福建省2份，臺灣省1份（表1）。將上述種質材料種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所，待長出新鮮葉片時進行取樣。主要試劑：EasyTaq DNA聚合酶、10×EasyTaq Buffer for PAGE和dNTPs等均購自武漢全式金生物技術有限公司。主要儀器設備：離心機（Eppendorf，德國）、NanoDrop 2000分光光度計（Thermo，美國）、PCR儀（Bio-Rad，美國）和凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）。

1. 2 DNA提取

采集甘薯新鮮幼嫩葉片，參照Yang等（2015）的改良CTAB方法提取甘薯葉片的基因組DNA。使用NanoDrop 2000分光光度計測定DNA濃度，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。將供試樣品DNA稀釋到50～60 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 PCR擴增

選擇10對在其他物種中擴增效果良好的cpDNA間隔區(qū)序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL等）通用引物（表2），由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，利用其對供試材料進行PCR擴增。反應體系：10×PAGE Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）2.0 μL，正、反向引物（10 mmol/L）各1.0 μL，基因組DNA（50～60 ng/uL）1.0 μL，EasyTaq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，54～58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共進行35個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存5 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳，獲得單一且清晰條帶，將檢測合格的PCR產(chǎn)物送到武漢天一輝遠生物科技有限公司進行雙向測序。

1. 4 統(tǒng)計分析

基于雙向測序結果，使用DNAStar對cpDNA間隔區(qū)序列進行手動校對，刪除序列兩端不可靠的堿基序列，將正向序列和反向序列進行拼接（Burland，2000）。利用MEGA X對拼接序列進行序列長度、核苷酸構成及變異位點等序列特征分析，并基于MEGA X中的Kimura-2-parameter（K2P）模型、最大簡約法（Maximum parsimony，MP）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Kumar et al.，2018）。利用DnaSP 5.0計算變異位點數(shù)（Variable site，Vs）、單一突變位點數(shù)（Singleton variable site，Ss）、簡約信息位點數(shù)（Parsimony informative site，Ps）、插入/缺失位點數(shù)（Insertion/deletion gaps，Is）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，π）、平均核苷酸差異（Average number of nucleotide difference，k）、單倍型數(shù)目（Number of haplotype，H）、單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd）、單倍型多樣性方差（Variance of haplotype diversity，Vh）和單倍型多樣性標準差（Standard deviation of haplotype diversity，Sh），最后計算Tajiams D、Fu and Lis D*及Fu and Lis F*進行中性檢驗（Neutrality tests）（Librado and Rozas，2009）。

2 結果分析

2. 1 cpDNA間隔區(qū)序列擴增結果

用10對cpDNA間隔區(qū)序列引物對甘薯種質材料進行PCR擴增，結果發(fā)現(xiàn)有7對引物（390F/1326R、rbcL、psbC-trnS、trnM-rbcL、trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）能擴增出單一、清晰明亮且穩(wěn)定的特異性條帶，其他3對引物擴增出非特異性條帶、擴增條帶模糊或無擴增條帶。對擴增結果良好的7對引物擴增產(chǎn)物測序結果進行分析，共獲得3個有效標記，分別是trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL（圖1）。

2. 2 trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列特征分析結果

利用篩選獲得的3對通用引物對52份甘薯種質材料進行PCR擴增，結果顯示trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列在52份甘薯種質材料中的擴增產(chǎn)物長度分別為843～881 bp、642～669 bp和861～883 bp，將各區(qū)域對位排列后的片段長度分別為792、604和843 bp，三者的拼接序列總長度為2239 bp。核苷酸構成分析結果顯示，trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列富含AT，其含量分別為62.23%～63.09%、64.86%～65.59%和73.48%～74.15%，GC含量分別為36.91%～37.77%、34.41%～35.14%和25.85%～26.52%;三者的拼接序列GC含量32.23%～32.70%，AT含量67.30%～67.77%。多態(tài)性分析結果（表2）顯示，trnL-trnF序列含有1個簡約信息位點，0個單一突變位點，0個插入/缺失位點;trnH-psbA序列多態(tài)性最高，含有1個簡約信息位點，8個插入/缺失位點，0個單一突變位點;trnT-trnL序列多態(tài)性最低，含有3個簡約信息位點。

52份甘薯種質材料的3個cpDNA間隔區(qū)拼接序列共含有變異位點7個，單一突變位點2個，簡約信息位點5個，插入/缺失位點11個。其中trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的變異位點分別為1、1和5個。trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的核苷酸多樣性（π）和平均核苷酸差異（k）分別為0.00022、0.00030、0.00036和0.177、0.177、0.440。三者的拼接序列核苷酸多樣性（π）和平均核苷酸差異（k）分別為0.00036和0.795（表2）。

2. 3 trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL單倍型多樣性分析結果

由表3可知，rnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列單倍型數(shù)目（H）分別為2、4和5個，其中，trnT-trnL序列的單倍型多樣性（Hd）最高，為0.184;trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的單倍型多樣性方差（Vh）和單倍型多樣性標準差（Sh）分別為0.00438、0.00505、0.00515和0.066、0.067、0.072;三者的拼接序列單倍型數(shù)目（H）、單倍型多樣性（Hd）、單倍型多樣性方差（Vh）和單倍型多樣性標準差（Sh）分別為10、0.575、0.00684和0.083。

2. 4 基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的中性檢驗結果

由表4可知，trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的Tajimas D分別為-0.26487、-0.26487和-1.44693;Fu and Lis D*分別為0.53980、0.53980和-0.84887;Fu and Lis F*分別為0.35578、0.35578和-1.20944。trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL序列的Tajimas D、Fu and Lis D*和Fu and Lis F*間均無顯著差異（P>0.05），符合中性進化模式。

2. 5 基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的甘薯種質親緣關系分析結果

采用MEGA X的最大簡約法基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL的拼接序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。使用自展法（Bootstrap）進行1000次檢測以確保獲得真實的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（自展值75%～100%表示強支持，50%～74%表示弱支持，小于50%表示不支持）。由圖2可知，52份甘薯種質材料間的遺傳距離為0～1.1848，平均遺傳距離0.1018，其分為五大類：第Ⅰ類僅包括1個品種，即浙紫薯3號;第Ⅱ類包括鄂薯6號、川菜薯211、濟農(nóng)51和廣菜薯6號;第Ⅲ類包括阜甜1號和皖薯7號;第Ⅳ類包括浙薯70、煙薯18、蘇薯24和莆薯53;其余41份甘薯種質歸為第Ⅴ類，該類中的自展值最低（小于50%），說明種質間的序列較一致，進化程度低。

3 討論

隨著越來越多植物的cpDNA序列測序完成，cpDNA已被廣泛用于種質資源鑒定、物種群體分類及系統(tǒng)進化分析等（Sabater，2018）。由于集團雜交是甘薯育種的主要手段，基于cpDNA序列進行甘薯遺傳多樣性分析及品種鑒定具有重要意義。本研究選取cpDNA的間隔區(qū)序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）對52份甘薯種質材料開展遺傳多樣性研究，是因為單一序列提供的信息量較有限（辛雅儒，2018），3個序列可提供不同的信息，與所選的基因功能和位置有關，trnH-psbA序列所受的選擇壓強較強，相較于其他2個序列更保守，結合3個序列獲得的結果則更準確。本研究發(fā)現(xiàn)，3個cpDNA間隔區(qū)序列中，trnT-trnL序列的變異位點（Vs）和簡約信息位點（Ps）均高于trnL-trnF和trnH-psbA序列，表明trnT-trnL序列能提供更多的變異信息;核苷酸多樣性（π）和單倍型多樣性（Hd）最高的序列分別為trnT-trnL（π=0.00052）和trnH-psbA（Hd=0.535），與高源等（2020）采用cpDNA間隔區(qū)序列對楸子遺傳多樣性的研究結果（π=0.00949，Hd=0.854）基本一致。與蘭花科植物的研究結果（π=0.00750，Hd=0.252）（Jin et al.，2017）相比，本研究中甘薯的遺傳多樣性低，其可能原因是本研究所用甘薯品種具有相同或相似的遺傳信息，還可能與本研究所用的3個cpDNA間隔區(qū)序列的進化速率有關，研究表明trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL間隔序列相對保守，需要更加精準的結果時則需要結合其他cpDNA間隔區(qū)序列（Katayama et al.，2011）。

cpDNA屬于母系遺傳，基因重組少，基因突變類型主要表現(xiàn)為點突變、堿基插入/缺失等（Na et al.，2014）。本研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸序列的變異中，插入/缺失位點總數(shù)最多，插入/缺失位點數(shù)（Is）和變異位點數(shù)（Vs）最多的序列分別為trnH-psbA（Is=8）和trnT-trnL（Vs=5）。3個cpDNA間隔區(qū)序列拼接后，單一突變位點（Ss）2個，簡約信息位點（Ps）5個，插入/缺失位點（Is）11個，與單一序列分析相比，拼接序列更能準確反映序列的多態(tài)性信息。中性檢驗結果顯示，trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL序列的Tajimas D、Fu and Lis D*和Fu and Lis F*間均無顯著差異，符合中性進化模式，暗示甘薯在進化過程中基因頻率的進化速率不按照一定方向進行，存在不同方向突變，并且不存在選擇壓力，而是中性地保存下來。

甘薯種質資源遺傳多樣性分析是甘薯種質創(chuàng)新利用及保護研究的重要環(huán)節(jié)。隨著育成品種的增多，基于形態(tài)特征來判斷種質間的差異越來越難，近年來結合形態(tài)特征和基因序列特征等方法，如Roullier等（2011）利用cpDNA開發(fā)的SSR分子標記對甘薯不同品種間的親緣關系和遺傳多樣性進行分析。本研究基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列對52份甘薯種質材料進行遺傳多樣性分析，將這3個序列拼接后共產(chǎn)生了10個單倍型，遠高于梨（常耀軍等，2014）、茶樹（劉振等，2018）、刺山柑（程波等，2019）等單倍型數(shù)目，甘薯的遺傳多樣性較低，一方面與甘薯是同源六倍體，雜交不親和有關;另一方面是經(jīng)過長期的引種馴化和人類定向選擇，導致甘薯的遺傳多樣性程度越來越低。本研究所用的52份甘薯種質材料的遺傳距離為0～1.1848，平均遺傳距離0.1018，表明52份甘薯種質的整體遺傳距離較近;基于拼接序列將所有材料分為五大類，其中鄂薯6號、川菜薯211、濟農(nóng)51和廣菜薯6號均聚為第Ⅱ類，表明4個甘薯品種在trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列基本保持一致，經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，鄂薯6號與川菜薯211的拼接序列一致，濟農(nóng)51和廣菜薯6號與鄂薯6號和川菜薯211相比，存在堿基缺失;第Ⅴ類的自展值小于50%，經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該類種質的拼接序列一致，可能原因是該類種質間具有相同的遺傳背景;浙紫薯3號被單獨聚類，表明與其他甘薯種質的核苷酸序列差異較大，具有單獨的進化路線，在選擇甘薯育種親本時，鄂薯6號、川菜薯211、濟農(nóng)51和浙紫薯3號等可優(yōu)先考慮?？梢?，cpDNA間隔區(qū)序列可用于分析甘薯遺傳多樣性和系統(tǒng)進化分析，若要更加準確地分析甘薯的親緣關系和遺傳多樣性，還需要結合核基因和線粒體基因標記等方法。

4 結論

52份甘薯種質材料的遺傳變異較為豐富，但種質材料間的遺傳多樣性低，與cpDNA特性和甘薯遺傳背景狹窄有關?；趖rnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL的拼接序列更能準確分析甘薯種質的遺傳多樣性，且有效劃分不同類群，為甘薯集團育種提供候選材料。

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（責任編輯 陳 燕）