非典型Stickler綜合征I型三個(gè)家系的遺傳分析及產(chǎn)前診斷

白周現(xiàn) 邵敬芝 吳慶華 孔祥東

作者單位：1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 遺傳與產(chǎn)前診斷中心 450000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科 450000

Stickler綜合征I型（Stickler syndrome type I，STL1）是一種罕見的常染色體顯性遺傳膠原結(jié)締組織病，主要以眼部異常、顱頜面畸形、聽力損傷及關(guān)節(jié)異常為特征性病變[1]。其眼部病變尤為突出，表現(xiàn)為高度近視、玻璃體變性、白內(nèi)障、復(fù)發(fā)性視網(wǎng)膜脫離等。已知COL2A1基因（Collagen type II alpha 1 chain）OMIM*120140（人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫基因編號(hào)）與Stickler綜合征相關(guān)，COL2A1基因變異可導(dǎo)致STL1 OMIM#108300 或OMIM#609508（即非典型STL1，非綜合征性眼?。?。非典型STL1患者與STL1患者相比通常僅有嚴(yán)重的眼部表型或伴有身體其他系統(tǒng)輕微表型[2，3]。由于STL1涉及多器官且表型復(fù)雜，非典型STL1的確診較為困難，基因檢測(cè)對(duì)該病的確診及鑒別具有重要參考意義。本研究收集到3個(gè)非典型STL1家系，為明確患者致病變異并行疾病診斷，對(duì)這些家系患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分析，報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

實(shí)驗(yàn)研究。2019年12月至2020年12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的主訴視力差或失明的先證者（遺傳病家系調(diào)查中第1 個(gè)確診的患者）且有生育健康后代要求，并檢出COL2A1基因致病變異的3個(gè)家系（見圖1）納入研究?；颊弑硇筒杉蚤T診病歷或本院住院病歷。

圖1.3個(gè)非典型Stickler綜合征I型家系圖Figure 1.Family trees of 3 families with atypical Stickler syndrome I(aSTL1).

家系1先證者（II1），男，5歲。1歲半時(shí)發(fā)現(xiàn)喜視近物，無眼球震顫，3歲時(shí)外院就診，診斷為“雙眼高度近視”，家長發(fā)覺其夜間視力稍差，懷疑色盲。否認(rèn)早產(chǎn)、難產(chǎn)史，否認(rèn)聽力異常，否認(rèn)關(guān)節(jié)軟骨畸形。雙眼檢影檢查示：右眼-22.00-2.50×35；左眼-21.50-1.75×140。視力檢查不合作。眼球前凸，眼前段無明顯異常，晶狀體透明，眼底呈豹紋狀。視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢查顯示：雙眼視錐、視桿反應(yīng)重度下降。面部特征：塌鼻梁，小下巴，無腭裂。其父（I1），33歲，高度近視，雙眼視網(wǎng)膜脫離（失明），感音神經(jīng)性聽力下降（高頻），無腭裂，無骨關(guān)節(jié)異常，無顱頜面部異常。其母（I2），32歲，健康。

家系2 先證者（I1），男，32 歲，先天性高度近視，雙眼視網(wǎng)膜脫離術(shù)后，右眼視力喪失，左眼僅剩光感；無腭裂，無全身其他表現(xiàn)。其妻（I2），31歲，健康。

家系3先證者（II1），男，40歲，8歲發(fā)病，12歲起視力損害嚴(yán)重，虹膜炎，有雙眼視網(wǎng)膜脫離史；大概20歲時(shí)已雙目失明，白內(nèi)障，之后無眼科診療經(jīng)歷；自述無聽力問題，無腭裂，無顱頜面異常，無骨關(guān)節(jié)異常（見圖2）。先證者母親（I2），66 歲，與先證者（II1）具有相同疾病，現(xiàn)亦失明，無眼科檢查及治療史，并拒絕眼科檢查。其父（I1），67歲，健康。其妹（II2），36歲，健康。

圖2.非典型Stickler綜合征I型家系3患者（II1）顱頜面部外觀及眼外觀Figure 2.Craniomaxillofacial appearance and ocular appearance of patient (II1) in family 3 with atypical Stickler syndrome I.

家系1孕婦（I2）和家系2孕婦（I2）了解風(fēng)險(xiǎn)并簽署知情同意書后，孕18 周時(shí)經(jīng)超聲引導(dǎo)下行羊水穿刺取得羊水細(xì)胞，不經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)直接用于產(chǎn)前診斷。

本研究嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言，所有受檢者簽署書面知情同意，獲鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：KS-2018-KY-36）。

1.2 二代測(cè)序

利用Nextera Flex靶向序列富集系統(tǒng)對(duì)全外顯子組進(jìn)行磁珠捕獲、目標(biāo)序列擴(kuò)增，通過Illumina Nova 6000 平臺(tái)（美國Illumina公司）進(jìn)行二代測(cè)序。捕獲序列的平均測(cè)序深度為100×，目標(biāo)序列的覆蓋度為97%。人類基因組參考序列版本選擇GRCh37。對(duì)靶向測(cè)序結(jié)果注釋篩選分析得到候選致病變異位點(diǎn)?？梢芍虏∽儺愇稽c(diǎn)的篩選要點(diǎn)為以下幾點(diǎn)：①患者疾病表型，如高度近視、失明、白內(nèi)障、顱面畸形、聽力損傷等；②遺傳病家族史；③STL1 的臨床表現(xiàn)；④了解疾病和致病基因變異的遺傳方式，結(jié)合患者表型、遺傳病家族史，篩選測(cè)序所得變異注釋信息，進(jìn)而鎖定目標(biāo)候選變異，⑤對(duì)候選變異行致病性分析。最后確認(rèn)候選致病變異位點(diǎn)。

1.3 Sanger測(cè)序

采集家系患者和健康對(duì)照者外周血2 ml，乙二胺四乙酸抗凝。使用磁珠法提取試劑盒Blood DNA Midi Kit D3494（美國 Omega bio-tek公司）和自動(dòng)化DNA提取工作站（Eppendorf epMotion 5075，德國艾本德公司）抽提外周血基因組DNA。以受檢者的基因組DNA為模板，使用Taq DNA聚合酶（立陶宛Fermentas公司）和特異引物（GeneTool設(shè)計(jì)）對(duì)COL2A1基因目標(biāo)位點(diǎn)序列進(jìn)行擴(kuò)增。使用純化柱法（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國QIAGEN公司）提取羊水細(xì)胞基因組DNA用于孕婦產(chǎn)前診斷，對(duì)相應(yīng)家系STL1致病變異位點(diǎn)行Sanger測(cè)序檢測(cè)。

PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30 次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的目的DNA片段純化，用熒光標(biāo)記終止物試劑盒（dGTP BigDye?Terminator，美國ABI公司）和Sanger測(cè)序試劑盒（Sequencing Kit，美國ABI公司）進(jìn)行測(cè)序。Sanger測(cè)序反應(yīng)參數(shù)：96 ℃預(yù)變性1 min；96 ℃10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，循環(huán)25次，4 ℃保存。采用乙醇/醋酸鈉純化，按BigDyeV3.1操作手冊(cè)進(jìn)行。將純化產(chǎn)物變性后，上樣測(cè)序儀（ABI 3130 xl測(cè)序儀，美國ABI公司）進(jìn)行序列分析。

1.4 變異致病性分析

檢索候選變異在人類基因變異數(shù)據(jù)庫HGMD（Human gene mutation database）、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫PubMed中的收錄或報(bào)道情況，被專業(yè)文獻(xiàn)報(bào)道過的相關(guān)變異為致病性證據(jù)支持的變異。通過查詢基因組整合數(shù)據(jù)庫GnomAD（The Genome Aggregation Database）了解該變異在人群中出現(xiàn)的頻率。參考2015 年版美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院與分子病理學(xué)協(xié)會(huì)（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的描述序列變異的聯(lián)合共識(shí)建議（簡(jiǎn)稱ACMG指南）[4]和《遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》[5]對(duì)候選變異致病性強(qiáng)度等級(jí)進(jìn)行判斷。采用GERP++軟件和MutationTaster工具對(duì)錯(cuò)義變異的氨基酸進(jìn)行序列保守性分析；利用SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster等蛋白預(yù)測(cè)軟件分析錯(cuò)義變異對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響，以判斷其致病性。

2 結(jié)果

2.1 二代測(cè)序篩查結(jié)果

使用全外顯子組測(cè)序法對(duì)家系1患者（II1）、家系2患者（I1）和家系3患者（II1）進(jìn)行測(cè)序分析，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)3例患者均檢測(cè)到COL2A1基因相關(guān)致病性變異，見表1。

2.2 候選變異Sanger測(cè)序驗(yàn)證

對(duì)于全外顯子組測(cè)序篩查得到的候選基因變異，家系1、2、3的所有患者及家系中的健康成員進(jìn)行了Sanger測(cè)序?qū)嶒?yàn)，以驗(yàn)證各個(gè)受檢者的相關(guān)變異攜帶情況。其中家系1 患者（I1、II1）攜帶COL2A1基因c.1693C>T（p.R565C）雜合變異，正常健康成員（I2）在該位點(diǎn)無變異，Sanger測(cè)序結(jié)果見圖3。家系2患者（I1）攜帶COL2A1基因c.2862C>T（p.G954=）雜合變異，正常健康成員（I2）在該位點(diǎn)無變異，Sanger測(cè)序結(jié)果見圖4。家系3 患者（I2、II1）攜帶COL2A1基因c.2355+1G>A雜合變異，正常健康成員（I1、II2）在該位點(diǎn)無變異，Sanger測(cè)序結(jié)果見圖5。

2.3 變異致病性分析

本研究中無血緣關(guān)系的3 個(gè)非典型STL1 家系檢出3 個(gè)候選致病基因COL2A1變異（見表1），這3個(gè)COL2A1變異均有國外相關(guān)病例攜帶報(bào)道。家系1中患者（I1、II1）COL2A1基因c.1693C>T雜合變異導(dǎo)致II型膠原α 1鏈第565位氨基酸由極性帶正電脂肪族精氨酸（Arg）替換為極性不帶電脂肪族半胱氨酸（Cys）（p.R565C），為錯(cuò)義突變，該變異人群中頻率為8×10-6，不屬于多態(tài)性位點(diǎn)；變異位點(diǎn)的氨基酸序列在物種間高度保守，SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster均預(yù)測(cè)COL2A1基因p.R565C變異有害；依據(jù)ACMG指南判斷COL2A1基因p.R565C變異為致病性（PS1+PS4+PP1+PP3+PP4）。家系2中患者（I1）COL2A1基因c.2862C>T雜合變異為同義突變（p.G954=），無氨基酸序列改變；有研究顯示該變異位點(diǎn)會(huì)影響COL2A1基因mRNA的可變剪切，導(dǎo)致第42 外顯子該變異位點(diǎn)后35 bp序列的刪除，進(jìn)而移碼突變產(chǎn)生功能紊亂的蛋白產(chǎn)物[7]，該變異在人群中頻率極低，GnomAD數(shù)據(jù)庫無記錄；依據(jù)ACMG指南判斷其為致病性（PVS1+PM2+PP4）。家系3中患者（I2、II1）COL2A1基因c.2355+1G>A雜合變異為經(jīng)典的可變剪接突變，該變異在GnomAD數(shù)據(jù)庫無人群頻率記錄，依據(jù)ACMG指南判斷其為致病性（PVS1+PM2+PP4）。

表1.非典型Stickler綜合征I型3個(gè)家系COL2A1基因變異情況Table 1.Variation of COL2A1 gene in three families with atypical Stickler syndrome type I

圖3.非典型Stickler綜合征I型家系1 患者（I1、II1）及正常者（I2）COL2A1基因c.1693C>T雜合變異和野生型的Sanger測(cè)序圖上圖紅色箭頭指向變異所在位置，下圖為對(duì)應(yīng)無變異的位置Figure 3.Sanger sequencing results of heterozygous variation and wild type of COL2A1 c.1693C>T in family 1 patients (I1,II1) and normal control (I2) with atypical Stickler syndrome I.The red arrow in the upper figure points to the mutation,the red arrow in the lower figure points to the corresponding site.

圖4.非典型Stickler綜合征I型家系2患者（I1）及正常者（I2）COL2A1基因c.2862C>T雜合變異和野生型的Sanger測(cè)序圖紅色箭頭指向變異所在位置Figure 4.Sanger sequencing results of heterozygous variation and wild type of COL2A1 c.2862C>T in family 2 patients (I1) and normal control (I2) with atypical Stickler syndrome I.The red arrow in the upper figure points to the mutation,the red arrow in the lower figure points to the corresponding site.

圖5.非典型Stickler綜合征I型家系3患者（I2、II1）及正常者（I1、II2）COL2A1基因c.2355+1G>A雜合變異和野生型的Sanger測(cè)序圖紅色箭頭指向變異所在位置Figure 5.Sanger sequencing results of heterozygous variation and wild type of COL2A1 c.2355+1G>A in family 3 patients (I2,II1) and normal control (I1,II2) with atypical Stickler syndrome I.The red arrow in the upper figure points to the mutation,the red arrow in the lower figure points to the corresponding site.

2.4 Stickler綜合征的產(chǎn)前診斷

家系1 孕婦（I2）和家系2 孕婦（I2）分別在孕18 周抽取胎兒羊水進(jìn)行了COL2A1基因相關(guān)位點(diǎn)Sanger測(cè)序檢測(cè)。家系1 中胎兒（II2）未檢測(cè)到COL2A1基因c.1693C>T（p.R565C）變異，因此該胎兒發(fā)展為與先證者（II1）相同基因變異導(dǎo)致的Stickler綜合征的可能性小。家系2中胎兒（II1）未檢測(cè)到COL2A1基因COL2A1基因c.2862C>T變異，因此該胎兒發(fā)展為與先證者（I1）相同基因變異導(dǎo)致的Stickler綜合征的可能性小。家系1和家系2孕婦都選擇了繼續(xù)妊娠，電話隨訪出生后情況如下：家系1男孩（II2），2月齡，未見顱頜面異常，新生兒聽力篩查通過，眼部及視力未發(fā)現(xiàn)異常；家系2 女孩（II1），7月齡，未見顱頜面異常，新生兒聽力篩查通過，眼部及視力未發(fā)現(xiàn)異常。

3 討論

本研究收集了3 個(gè)非典型STL1 家系患者，他們的病變主要集中在眼部，包括高度近視、視力差或失明、視網(wǎng)膜脫離、白內(nèi)障，不伴其他異常或伴有其他輕微（輕度）表型。依據(jù)孟德爾遺傳定律，STL1 為常染色體顯性遺傳病。針對(duì)這3 個(gè)家系進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序分析，通過臨床表型結(jié)合遺傳分析，我們?cè)诜肿舆z傳水平幫助這3個(gè)家系患者確診COL2A1基因變異導(dǎo)致的非典型STL1，找到了他們各自的遺傳學(xué)病因；并對(duì)其中2個(gè)家系進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，使其獲得健康后代。

COL2A1基因編碼II型膠原蛋白α1 鏈，II型膠原蛋白是一種在軟骨和眼球玻璃體中發(fā)現(xiàn)的纖維膠原。3條完全相同的α1鏈折疊形成一種左手螺旋的三螺旋分子結(jié)構(gòu)為II型膠原蛋白。COL2A1基因位于染色體12q13.11，由54 個(gè)外顯子組成，編碼1487個(gè)氨基酸。三螺旋結(jié)構(gòu)的核心區(qū)域（第6─48外顯子編碼）由一段（甘氨酸-X-Y）n重復(fù)序列組成，它對(duì)大分子三螺旋結(jié)構(gòu)有重要意義[10]。有研究認(rèn)為攜帶位于甘氨酸突變的患者在STL1 中僅約占6%，但常表現(xiàn)出較嚴(yán)重的骨骼系統(tǒng)異常，X和Y位的氨基酸突變的患者骨骼異常較輕[1]。早前有研究認(rèn)為COL2A1基因2號(hào)以外的外顯子變異常引起包括眼在內(nèi)的全身性結(jié)締組織病變及全身性臨床特征[11]。COL2A1基因2號(hào)外顯子發(fā)生變異時(shí)，STL1主要表現(xiàn)以眼部病變特征為主、無或僅有輕微其他器官組織癥狀[11，12]。McAlinden等[2]利用小基因構(gòu)建的體外研究表明，2號(hào)外顯子變異導(dǎo)致剪接模式的改變和IIA、IIB型mRNA表達(dá)率的降低。由于IIA亞型在成人眼玻璃體中表達(dá)，眼部表型可能是由于成熟眼中IIA亞型數(shù)量不足所致，而改變剪接產(chǎn)生足夠的IIB亞型可能使患者缺乏眼外表型。而本研究的3個(gè)非典型STL1家系COL2A1基因變異均不在2號(hào)外顯子區(qū)域，這也反映出該病的遺傳異質(zhì)性和該病的復(fù)雜性。STL1在國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道較少[13]，其中只有部分病例通過分子遺傳檢測(cè)COL2A1基因變異而確診，如COL2A1基因c.1693C>T（p.R565C）雜合變異的非典型STL1 患者[14]、COL2A1基因c.763-1delG雜合變異的STL1患者[15]。

本研究中3 個(gè)非典型STL1 家系患者分別攜帶COL2A1基因c.1693C>T（p.R565C）、COL2A1基因c.2862C>T（p.G954=）、COL2A1基因c.2355+1G>A致病變異。家系1 中COL2A1基因c.1693C>T（p.R565C）雜合變異導(dǎo)致的患者父子（I1、II1）和國內(nèi)另1例因該變異導(dǎo)致的患者[14]沒有腭裂及嚴(yán)重骨骼問題，他們均為非典型STL1；而國外報(bào)道的該變異患者表型嚴(yán)重，包括眼部異常、腭裂、關(guān)節(jié)問題等，為STL1[6]。p.R565C位于COL2A1基因甘氨酸-X-Y重復(fù)序列區(qū)的X位氨基酸，因此攜帶該變異的家系1中的2例患者和國內(nèi)報(bào)道的那例患者表型較輕；攜帶該變異的國外病例疾病表型較重，這提示相同基因變異的患者臨床表現(xiàn)也具有異質(zhì)性，且基因型和表型之間關(guān)系復(fù)雜。家系2中COL2A1基因c.2862C>T（p.G954=）雜合變異導(dǎo)致的患者（I1）為非典型STL1，該表型國內(nèi)未見報(bào)道；國外報(bào)道的該變異導(dǎo)致的患者為STL1。家系3中COL2A1基因c.2355+1G>A雜合變異導(dǎo)致的患者（II1、I2）為非典型STL1，該表型在國內(nèi)未見報(bào)道；國外該變異導(dǎo)致的患者臨床表型有高度近視、中短面部、小下頜、腭裂、皮-羅序列征，聽力正常、骨關(guān)節(jié)正常等[9]。STL1表型復(fù)雜，具有遺傳和臨床表型異質(zhì)性，本研究顯示致病性已知的相同變異導(dǎo)致的Stickler綜合征的不同患者表型嚴(yán)重程度也有差異性，這對(duì)于STL1的臨床特征的認(rèn)識(shí)和診斷非常有意義。臨床上非典型Stickler綜合征病例較為少見，分子遺傳檢測(cè)可以確診并明確分型以幫助治療。缺少基因檢測(cè)將使該病與其他多種相關(guān)疾病的鑒別診斷變得復(fù)雜。

本研究從STL1的臨床表現(xiàn)和遺傳變異水平闡明了3個(gè)不同家系的患者的致病原因，分析了相關(guān)基因變異的致病性，報(bào)道了患者的臨床表型。本研究的結(jié)果證明了常色體顯性遺傳非典型STL1遺傳異質(zhì)性及疾病表型的復(fù)雜性，為理解該病的分子病理機(jī)制提供了更多信息，為非典型STL1的檢查確診、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了理論依據(jù)。由于一些疾病較為罕見，又受到國內(nèi)不同醫(yī)院眼科檢查設(shè)備水平及醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)所限，分子遺傳學(xué)檢測(cè)對(duì)非典型STL1 的診斷具有重要的參考價(jià)值。同時(shí)，利用相應(yīng)的分子遺傳檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行的產(chǎn)前診斷也有效地阻斷了非典型STL1向子代傳遞，幫助患者家庭獲得了健康后代。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明白周現(xiàn)：收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計(jì)及資料的分析和解釋；撰寫論文；對(duì)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。邵敬芝：參與設(shè)計(jì)和修改論文的結(jié)果、結(jié)論，對(duì)編輯部的修改意見進(jìn)行核修。吳慶華：參與資料的分析和解釋，修改論文中結(jié)果、結(jié)論?？紫闁|：參與選題、設(shè)計(jì)、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論