一株高產(chǎn)苯乳酸菌株的安全性評(píng)價(jià)與發(fā)酵工藝優(yōu)化

侯楠楠，謝全喜，王梅，王倩，鹿曉慧，周紅，谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271000）

霉菌毒素污染，防腐防霉劑使用不當(dāng)導(dǎo)致我國(guó)食品、飼料等行業(yè)上存在很多問題，主要反映在食品安全性差、飼料保質(zhì)期短等方面[1,2]。

苯乳酸也稱3-苯乳酸或β-苯乳酸，是一種廣泛存在自然界中的小分子天然有機(jī)酸，其分子式為C9H10O3，相對(duì)分子質(zhì)量為166[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，苯乳酸是可以由部分乳酸菌分泌的一種具有廣譜抗菌性的新型抑菌劑，能抑制食源性致病菌、腐敗菌，尤其能抑制真菌的污染；且溶解性好、易于在食品體系中擴(kuò)散；具有穩(wěn)定性高、寬廣的pH 適應(yīng)性范圍和熱穩(wěn)定性[4-6]。1998 年，Dieuleveux[7]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的干酪在成熟過程中產(chǎn)生苯乳酸對(duì)食源致病菌具有很強(qiáng)的抑制作用；2000 年，Lavremicocca[8]等進(jìn)一步確定苯乳酸的廣譜抑菌效果。苯乳酸作為天然防腐劑價(jià)格高昂，目前合成方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。其中化學(xué)合成存在許多不利因素，比如技術(shù)條件復(fù)雜、反應(yīng)條件嚴(yán)苛、環(huán)境污染比較大等；生物合成苯乳酸是一種新方法。研究發(fā)現(xiàn)很多菌株都可以產(chǎn)生苯乳酸，如乳桿菌[4]、白地霉[8]、芽孢桿菌[9]、丙酸菌[10]、戊糖片球菌[11]等，但各種菌株間的產(chǎn)量差異比較大。微生物可以利用發(fā)酵過程中的多酶體系將前體化合物合成苯乳酸，例如牛的瘤胃微生物能夠利用苯丙氨酸合成苯乳酸，大量微生物可以利用乳酸脫氫酶在NADH 作用下利用苯丙酮酸合成苯乳酸[12,13]。微生物在合成苯乳酸起到防腐效果的同時(shí)還能產(chǎn)生其它有機(jī)酸成分，是目前普遍認(rèn)可的一種成本低、效果好、使用安全的方法。乳酸菌作為重要的益生菌，是GRAS 認(rèn)證（Generally Recognized as Safe）微生物，在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用可以改善食品風(fēng)味，提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保鮮性能，乳酸菌來源的苯乳酸成為研究的熱點(diǎn)[14,15]。因此篩選高產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌，提高苯乳酸產(chǎn)量具有重要意義。

本研究借助高效液相色譜法篩選出高產(chǎn)苯乳酸的菌株，對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定、安全性評(píng)價(jià)并對(duì)產(chǎn)苯乳酸發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，為菌株安全應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 乳酸菌

菌株BLCC2-0069、菌株BLCC2-0021 和菌株BLCC2-0410，均由山東寶來利來生物工程股份有限公司生物工程研究院菌種資源保藏中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS 液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏8 g、酵母膏4 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.3 g、檸檬酸銨2 g、乙酸鈉5 g、吐溫-80 1 mL，蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)pH 值至6.0，121℃滅菌30 min 備用。MRS 固體培養(yǎng)基按照1.5%加入進(jìn)口瓊脂。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母膏、牛肉膏：天津市英博生化試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳：濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司；檸檬酸銨：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；乙酸鈉：青島捷世康生物科技有限公司；吐溫-80：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸和甲醇（均為色譜級(jí)）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉：北京索萊寶科技有限公司；微孔濾膜（直徑13 mm、孔徑0.22 μm）：上海安譜有限公司；苯丙氨酸（分析純，純度≥99.5%）、苯丙酮酸（分析純，純度≥99.5%）、DL-3 苯乳酸（分析純，純度≥98%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高產(chǎn)苯乳酸菌株的篩選

將超低溫冰箱（-80℃）保存的乳酸菌菌株BLCC2-0069、BLCC2-0021 和BLCC2-0410 凍干粉分別接種于MRS 固體斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下用接種環(huán)挑取一環(huán)接種至MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h 和48 h，4000 r/min 離心10 min，取發(fā)酵上清液備用，采用高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵上清液中苯乳酸含量。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

挑取產(chǎn)苯乳酸效果最好的菌株的純培養(yǎng)物接種于MRS 固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將目的菌株接種于新鮮的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，采用天根公司的試劑盒提取菌體DNA，并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA 序列擴(kuò)增。所用引物為通用引物：

1492r：5,-ggttaccttgttacgactt-3，（SEQ ID NO.2）；27f：5,-agagttgatcctggctcag-3，（SEQ ID NO.3）。

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）為：Mixture 25 μL（含Taq DNA 聚合酶及d NTP 等，天根生化科技有限公司），上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，超純水21 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，25 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 菌株安全性試驗(yàn)

1.2.3.1 菌粉制備

植物乳桿菌BLCC2-0069 中試試驗(yàn)后，發(fā)酵液立即離心凍干，制備凍干菌粉，活菌數(shù)≥1.0×1011cfu/g。

1.2.3.2 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小白鼠（許可證號(hào)SYXK（魯）20130002），體重20±2 g，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

1.2.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)28 天經(jīng)口毒性試驗(yàn)》[16]動(dòng)物飼養(yǎng)法以及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》[17]限量法進(jìn)行毒性試驗(yàn)。選擇體重20.00±2.00 g健康昆明種小鼠120 只，雌雄各半?；A(chǔ)日糧預(yù)飼一周后隨機(jī)分為4 組，每組30 只，雌雄各15 只，分籠喂養(yǎng)，其中一組為對(duì)照組，其余三組為試驗(yàn)組，分別灌胃1.0×108cfu/mL、1.0×109cfu/mL 和1.0×1010cfu/mL 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 菌液。

1.2.3.4 給藥

動(dòng)物飼養(yǎng)法給藥方式為灌胃，各組小鼠禁食16 h后，對(duì)照組灌胃生理鹽水，其余三個(gè)試驗(yàn)組分別灌胃生理鹽水稀釋好的菌粉，按照0.4 mL/20 g 體重的受試樣品量進(jìn)行灌胃給樣，連續(xù)灌胃2 d，每次灌胃后密切觀察2 h，2 h 后常規(guī)飲食，連續(xù)觀察14 d，每天定時(shí)觀察記錄。

1.2.3.5 觀察指標(biāo)

（1）肉眼觀察：詳細(xì)記錄被毛和皮膚、眼睛和粘膜、呼吸、循環(huán)、自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體活動(dòng)和行為等改變。特別注意是否出現(xiàn)震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。記錄毒作用體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間和死亡時(shí)間。

（2）小鼠體重：于試驗(yàn)開始時(shí)、7 d 和14 d 分別對(duì)每組雌雄小鼠進(jìn)行稱重，比較其體重情況。

（3）病理學(xué)檢查：14 d 時(shí)對(duì)各組小鼠全部進(jìn)行尸檢，觀察臟器器官病變，對(duì)觀察有變化的臟器需進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.4 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 發(fā)酵工藝研究

1.2.4.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 發(fā)酵pH 值和活菌數(shù)的影響

將培養(yǎng)好的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 種子液按照2.00%接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，每隔2 h 取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH值和活菌數(shù)。

1.2.4.2 發(fā)酵底物對(duì)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 發(fā)酵液苯乳酸含量的影響

將培養(yǎng)好的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 種子液按照2.00%接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，接種3 組，每組3 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)1 組：MRS 液體培養(yǎng)基中額外添加3.00 g/L 苯丙氨酸；試驗(yàn)2 組：MRS 液體培養(yǎng)基中額外添加3.00 g/L苯丙酮酸；第3 組為對(duì)照組，不額外添加任何添加劑，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液4000 r/min 離心10 min，棄菌體，取發(fā)酵上清液采用高效液相色譜法檢測(cè)被試菌株發(fā)酵液中苯乳酸含量。

1.2.4.3 苯丙酮酸添加量對(duì)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 發(fā)酵液苯乳酸含量的影響

將培養(yǎng)好的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 種子液按照2.00%接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，共接種4 組，每組3 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)1 組、2 組、3 組和4 組分別在MRS 液體培養(yǎng)基中額外添加0 g/L、1.00 g/L、3.00 g/L 和5.00 g/L 苯丙酮酸，均放入37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h 和48 h，取發(fā)酵液4000 r/min 離心10 min，棄菌體，取發(fā)酵上清液檢測(cè)被試菌株發(fā)酵液中苯乳酸含量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 植物乳桿菌活菌數(shù)的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取乳酸菌發(fā)酵液1 mL，用生理鹽水10 倍梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品至MRS 平皿培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算樣品中乳酸菌活菌數(shù)，結(jié)果用cfu/mL 表示。

1.3.2 苯乳酸含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取DL-3 苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品0.2058 g（實(shí)含苯乳酸0.2048 g）用超純水溶解后定容至100 mL，配制成2.048 g/L 的苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后從中分別吸取0.62 mL、1.25 mL、2.50 mL 和5.00 mL 用超純水定容至10.0 mL，各組質(zhì)量濃度如表1。

表1 苯乳酸溶液濃度梯度組成 Table 1 The concentration gradient composition of phenyllactic acid solution

濃度由低至高進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積和濃度作圖，得到苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，為：

待測(cè)樣品苯乳酸的提?。喊l(fā)酵液經(jīng)10000 r/min，離心5 min 和0.22 μm 濾膜過濾后，采用島津LC-20A高效液相色譜，島津SPD-20A 紫外檢測(cè)器進(jìn)行分析。

HPLC 法測(cè)定苯乳酸含量：色譜條件為色譜柱：InertSustain AQ-C18 (5 μm 4.6×250 mm)（W），柱溫箱：30℃，進(jìn)樣量：20 μL，流速：1.0 mL/min。流動(dòng)相A：0.05%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B：0.05%三氟乙酸甲醇溶液；梯度洗脫條件：0～15 min 流動(dòng)相B 的比例由40%升至80%，15～16 min 流動(dòng)相B 的比例保持80%，16～18 min 流動(dòng)相B 的比例由80%降至40%，洗脫完成后，波長(zhǎng)210 nm 檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007 進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）程序進(jìn)行方差分析，LSD 法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜圖（圖1，苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度2.05 g/L），可以看出，在9.5 min 左右出現(xiàn)苯乳酸色譜峰，且穩(wěn)定性良好、分離效果好、峰型理想、靈敏度高。

圖1 苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜圖 Fig.1 HPLC chromatogram of phenyllactic acid standard

由圖2 發(fā)酵上清液的HPLC 色譜圖可以看出，乳酸菌發(fā)酵上清液苯乳酸色譜峰，分離效果好，峰型理想。

圖2 發(fā)酵上清液液的HPLC 色譜圖 Fig.2 HPLC chromatogram of fermentation supernatant

2.2 高產(chǎn)苯乳酸菌株的篩選

由表2 可知，24 h 時(shí)菌株BLCC2-0069 發(fā)酵液中苯乳酸含量最高，為1.26 g/L，顯著高于其余各菌株（p<0.05）；48 h 時(shí)菌株BLCC2-0069 發(fā)酵液中苯乳酸含量為1.43 g/L，分別高于菌株BLCC2-0021 和BLCC2-0410 的58.21%和8.79%，差異顯著（p<0.05）。綜合分析24 h 和48 h 發(fā)酵液中苯乳酸含量結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)優(yōu)選產(chǎn)苯乳酸最高的菌株BLCC2-0069 為研究對(duì)象。

表2 不同菌株發(fā)酵液對(duì)苯乳酸含量的影響（g/L）Table 2 Effects of different strains of fermentation broth on the content of phenyllactic acid (g/L)

Lavermicocca[8]從酸面團(tuán)中分離到的L.plantaom2I B，產(chǎn)生的苯乳酸量為56.00 mg/L，這是關(guān)于乳酸菌產(chǎn)生苯乳酸的首次報(bào)道；隨后研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不同種屬的乳酸菌也能夠產(chǎn)生苯乳酸，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下篩選得到的乳酸菌其苯乳酸產(chǎn)量多在1.0 g/L 以下。例如李士龍[18]通過抑菌試驗(yàn)結(jié)合反相高效液相色譜法，篩選到一株乳酸菌苯乳酸產(chǎn)量為246 mg/L。李明華[19]通過溶鈣圈法和瓊脂柱抑菌實(shí)驗(yàn)法篩選到一株植物乳桿菌苯乳酸產(chǎn)量為89.30 mg/L。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)公司優(yōu)選菌株的篩選，得到1 株高產(chǎn)苯乳酸菌株BLCC2-0069，24 h 時(shí)該菌株發(fā)酵液中苯乳酸含量為1.26 g/L，高于國(guó)內(nèi)外有關(guān)益生菌產(chǎn)苯乳酸報(bào)道。

2.3 菌株BLCC2-0069 鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株BLCC2-0069 在37℃培養(yǎng)48 h 后，培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為白色、凸起、光滑、濕潤(rùn)、易挑?。ㄈ鐖D3 所示），在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)為桿狀，單獨(dú)、成對(duì)或短鏈排列（如圖4 所示），從菌落形態(tài)和菌體形態(tài)上初步判斷為一種乳桿菌。

圖3 乳酸菌BLCC2-0069 菌落形態(tài)圖 Fig.3 Colonial morphology of BLCC2-0069

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株BLCC2-0069 的16S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在分子量大小為1500 bp 左右得到一條特異性好的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，并進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序序列與http://www.ncbi.nlm.nih.gov 網(wǎng)站上已登錄的部分菌株的 16S rDNA 基因序列進(jìn)行比對(duì)，將BLCC2-0069 的16S rDNA 序列與不同乳桿菌模式菌株16S rDNA 序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示，該菌株與已報(bào)道的Lactobacillus plantarumMT464064.1 和 MG983980.1 相似度最高，鑒定BLCC2-0069 菌株屬于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。同時(shí)也進(jìn)一步佐證了表型特征、生理生化特性仍可以作為乳酸菌分類的重要指標(biāo)之一，依據(jù)生化特征來劃分仍具有一定可行性。

圖5 BLCC2-0069 系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.5 Phylogenetic tree of BLCC2-0069

將BLCC2-0069 送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏（地址為武漢市武漢大學(xué)），保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2020388。

2.4 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 安全性試驗(yàn)

2.4.1 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 菌粉對(duì)各組小鼠（雌性和雄性）的生長(zhǎng)和死亡情況的影響

由表3 可知，在14 d 觀察期內(nèi)，雌/雄性小鼠體態(tài)觀察正常，四肢活動(dòng)正常，對(duì)體重?zé)o顯著性影響，各組均沒有出現(xiàn)死亡情況。解剖仔細(xì)觀察肝臟、腎臟和脾臟，均無肉眼可見病變。

表3 BLCC2-0069 菌粉對(duì)小鼠生長(zhǎng)和死亡情況的影響 Table 3 Effect of BLCC2-0069 on the growth and death of mice in each group

2.4.2 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 菌粉對(duì)各組小鼠的器官指數(shù)的影響

由表 4 可知，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 菌粉對(duì)各試驗(yàn)組小白鼠的脾臟指數(shù)和肝體比沒有顯著性影響。益生菌在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，其消費(fèi)量不斷增加，但有關(guān)益生菌的負(fù)面性報(bào)道卻很少見到，這與益生菌的安全性評(píng)價(jià)密不可分。國(guó)際上對(duì)乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)主要是毒理學(xué)、機(jī)體評(píng)級(jí)以及代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)等。其中動(dòng)物試驗(yàn)是確定乳酸菌安全性的一項(xiàng)重要手段。本試驗(yàn)中采用1.0×108cfu/mL、1.0×109cfu/mL 和1.0×1010cfu/mL 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 菌粉按照0.4 mL/20 g 體重的受試樣品量進(jìn)行灌胃給樣，連續(xù)給藥14 d 觀察試驗(yàn)小鼠的皮膚、毛發(fā)、中毒、死亡情況等，均無異常，說明所試菌株對(duì)小鼠各器官均無影響，同時(shí)適量攝入該菌株也未對(duì)小鼠的采食量產(chǎn)生影響；腎臟、肝臟是機(jī)體重要的排毒器官[20]，通過剖檢試驗(yàn)結(jié)果可以證明所試菌株對(duì)小鼠毒性不顯著，進(jìn)一步確定植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069安全性。王夢(mèng)嬌[21]采用乳酸菌1.0×108、1.0×107、1.0×106cfu/g 體重給小鼠灌胃，連續(xù)灌胃30 d，每天記錄小鼠的一般行為表現(xiàn)、中毒現(xiàn)象以及死亡情況，30 d 后剖檢試驗(yàn)組小鼠無異常，菌株安全；張曉妹等[22]篩選得到一株長(zhǎng)雙歧桿菌采用灌胃試驗(yàn)和急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，以1.0×108、1.0×109、1.0×1010cfu/鼠的菌株劑量飼喂小鼠28 d，未發(fā)現(xiàn)不良現(xiàn)象，其血液、肝臟、腎臟未發(fā)現(xiàn)該菌株。

表4 BLCC2-0069 菌粉對(duì)各組小鼠器官指數(shù)的影響 Table 4 Effect of BLCC2-0069 on organ index of mice in each group

2.5 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 發(fā)酵工藝研究

2.5.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 發(fā)酵pH 值和活菌數(shù)的影響

圖6 BLCC2-0069 液體發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)取樣pH 值測(cè)定結(jié)果 Fig.6 BLCC2-0069 pH value of liquid fermentation at different times

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 于MRS 液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，初始pH 值為5.86，0～4 h 時(shí)比較穩(wěn)定維持在5.6 左右，隨后開始下降，pH 值的降低，是由于菌株發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸等有機(jī)酸導(dǎo)致。從活菌數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中可以看出其在0～4 h 處于延滯期，6～10 h 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。這與6 h 開始pH 值出現(xiàn)顯著降低現(xiàn)象相應(yīng)，菌株大量繁殖，產(chǎn)生大量有機(jī)酸，pH 值相應(yīng)降低。10 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，活菌數(shù)最高為1.78×109cfu/mL。這一結(jié)果與徐瓏倩研究的植物乳桿菌P158 的研究結(jié)果相似，菌株在4～6 h 左右開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[23]。

圖7 BLCC2-0069 液體發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)取樣活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果 Fig.7 BLCC2-0069 number of viable bacteria at different time points in liquid fermentation

2.5.2 發(fā)酵底物對(duì)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 發(fā)酵液苯乳酸含量的影響

單純依靠菌株自身產(chǎn)苯乳酸，能力有限，學(xué)者們通過誘變菌株、改良培養(yǎng)基或是添加底物的方法來提高苯乳酸的產(chǎn)量。劉晨等[24]利用質(zhì)量濃度3 g/L 的亞硝基胍誘變40 min，紫外照射90 s 時(shí)獲得1 株苯乳酸產(chǎn)量最高的變異株UN-30，苯乳酸產(chǎn)量可達(dá)712 mg/L；黃國(guó)昌[25]通過對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，苯丙氨酸8.3 g/L、牛肉浸粉1.8 g/L，優(yōu)化后苯乳酸產(chǎn)量提高至1.67 g/L；李士龍[18]通過添加苯丙氨酸的方法，篩選得到一株植物乳桿菌苯乳酸產(chǎn)量高達(dá)2.13 g/L。但李興峰等[26]研究發(fā)現(xiàn)：在乳酸菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的過程中，轉(zhuǎn)氨反應(yīng)是限速步驟，成為苯乳酸產(chǎn)生的瓶頸，可以采用苯丙酮酸代替苯丙氨酸作為底物合成苯乳酸，在本研究中也有同樣發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添苯丙酮酸時(shí)苯乳酸的產(chǎn)量要高于添加苯丙氨酸。本試驗(yàn)中分別測(cè)定植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 以苯丙氨酸和苯丙酮酸為底物發(fā)酵24 h發(fā)酵液的pH值、乳酸菌活菌數(shù)、乳酸含量和苯乳酸含量，結(jié)果見表5。苯丙氨酸/苯丙酮酸是兩種芳香族氨基酸或代謝產(chǎn)物，在機(jī)體內(nèi)具有重要生理功能，研究表明適量添加至日糧中對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)能力、記憶水平、運(yùn)動(dòng)能力和淋巴細(xì)胞增殖具有較高改善效果[26]。但本研究中發(fā)現(xiàn)兩種底物對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有一定影響，這可能與二者的代謝產(chǎn)物苯乳酸有關(guān)，乳酸菌在利用苯丙酮酸/苯丙氨酸產(chǎn)生大量苯乳酸，苯乳酸可能會(huì)對(duì)乳酸菌產(chǎn)生一定抑制作用；也可能與兩種底物自身延緩了乳酸菌的生長(zhǎng)速度有關(guān)。但對(duì)發(fā)酵液的pH 值以及菌株的產(chǎn)酸效果影響不大。以苯丙酮酸為底物時(shí)發(fā)酵液中苯乳酸含量最高為3.97 g/L，顯著高于對(duì)照組和苯丙氨酸組（p<0.05）。以苯丙氨酸為底物時(shí)發(fā)酵液中苯乳酸含量次之為2.10 g/L，顯著高于對(duì)照組66.72%（p<0.05）。選擇苯丙酮酸作為底物發(fā)酵產(chǎn)苯乳酸的效果要優(yōu)于苯丙氨酸。這一結(jié)論與李興峰[27]的研究發(fā)現(xiàn)相一致。究其原因可能是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 合成苯乳酸的過程中，底物苯丙酮酸可在脫氫酶的作用下直接轉(zhuǎn)換成苯乳酸。而苯丙氨酸無法直接合成苯乳酸，它需要先經(jīng)過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成苯丙酮酸，再經(jīng)過還原反應(yīng)將苯丙酮酸轉(zhuǎn)化成苯乳酸。

表5 不同底物對(duì)BLCC2-0069 發(fā)酵液苯乳酸含量的影響 Table 5 The influence of different substrates on the phenyllactic acid content of BLCC2-0069 fermentation broth

2.5.3 苯丙酮酸添加量對(duì)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 發(fā)酵液苯乳酸含量的影響

為了實(shí)現(xiàn)最大苯乳酸獲得率，本研究還進(jìn)一步對(duì)苯丙酮酸的添加量進(jìn)行分析，苯丙酮酸不同添加量對(duì)苯乳酸含量的影響結(jié)果如表6 所示。發(fā)酵24 h 和48 h時(shí)，苯乳酸含量隨苯丙酮酸添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中以苯丙酮酸添加3.00 g/L 時(shí)苯乳酸含量最高，分別達(dá)到3.66 g/L 和4.23 g/L，顯著高于其余各添加組（p<0.05）；24 h 和48 h 時(shí)添加3.00 g/L苯丙酮酸為底物發(fā)酵苯乳酸含量分別是未添加時(shí)的2.90 倍和2.91 倍，差異顯著（p<0.05）。究其原因可能與參與苯乳酸合成酶的數(shù)量有關(guān)，培養(yǎng)基中脫氫酶有限，隨著苯丙酮酸添加量的增加，參與反應(yīng)的酶達(dá)到飽和，再增加苯丙酮酸添加量不再繼續(xù)反應(yīng)。而隨著苯丙酮酸添加量的增加，可能會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定影響，導(dǎo)致苯乳酸的產(chǎn)量出現(xiàn)下降的情況。對(duì)比發(fā)酵24 h和48 h苯乳酸的產(chǎn)量可以發(fā)現(xiàn)，菌株在前期開始大量產(chǎn)生，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)苯乳酸合成總量會(huì)有一定積累，但速度明顯下降，這與該菌株的生長(zhǎng)曲線也是相呼應(yīng)的。與鄧林[28]苯丙酮酸濃度10 g/L搖瓶轉(zhuǎn)速為100 r/min 條件下24 h 時(shí)獲得最大苯乳酸含量為3.86 g/L 的研究結(jié)果相似，雖然在相同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)量略有差異，但在底物添加量上成本明顯減少，存在的差異可能是受到菌株自身產(chǎn)苯乳酸能力的影響；同時(shí)該研究結(jié)果顯著高于黃國(guó)昌[25]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加8.3 g/L 苯丙氨酸的方法；說明添加苯丙酮酸具有顯著提高植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 發(fā)酵液中苯乳酸含量的效果，且以3.00 g/L 添加時(shí)效果最佳。

表6 苯丙酮酸添加量對(duì)BLCC2-0069 發(fā)酵液苯乳酸含量的影響（g/L）Table 6 The effect of the amount of phenylpyruvate added on the content of phenyllactic acid in the fermentation broth of BLCC2-0069 (g/L)

3 結(jié)論

3.1 篩選得到一株高產(chǎn)苯乳酸的菌株BLCC2-0069，24 h 發(fā)酵苯乳酸產(chǎn)量為1.26 g/L，48 h 發(fā)酵苯乳酸產(chǎn)量為1.43 g/L 高于國(guó)內(nèi)外有關(guān)益生菌產(chǎn)苯乳酸報(bào)道；通過菌株形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定其為植物乳桿菌。

3.2 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 的小鼠體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未對(duì)試驗(yàn)小鼠造成形態(tài)、行為和動(dòng)作異常，未見小鼠死亡，對(duì)肝臟、腎臟和脾臟等均無肉眼可見病變，初步確定該菌株的體內(nèi)安全性。

3.3 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069 以苯丙酮酸為底物發(fā)酵產(chǎn)苯乳酸的效果要優(yōu)于以苯丙氨酸為底物，且以3.00 g/L 苯丙酮酸添加時(shí)24 h 發(fā)酵苯乳酸產(chǎn)量為3.66 g/L，48 h 發(fā)酵苯乳酸產(chǎn)量為4.23 g/L 效果最佳。