阿魏側(cè)耳胞外多糖分離純化及其免疫活性研究

王晶，喬潔，裴新云，常世民，劉學(xué)娟,3，閆訓(xùn)友

1(廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊，065000)2(河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 廊坊，065000)3(廊坊市細(xì)胞工程與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 廊坊，065000)

多糖，又稱為聚糖，一般指由10個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成高分子化合物[1]。多糖在自然界中分布廣泛，在真菌細(xì)胞壁中約占90 %[2]，具有免疫調(diào)節(jié)[3]、調(diào)節(jié)腸道菌群[4]、降血糖[5-6]、降血脂[5]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]和保濕[9]等多種生物學(xué)功能。多糖分為胞內(nèi)多糖、胞壁多糖和胞外多糖3種[10]，與胞內(nèi)多糖不同，真菌胞外多糖易與菌體分離，可通過(guò)液體發(fā)酵獲得，具有生產(chǎn)周期短、成本低和易于控制等優(yōu)勢(shì)[11]。

阿魏側(cè)耳(P.ferulaeLanzi)，是一種食藥兼用的擔(dān)子菌，具有抗腫瘤、提高免疫力[12]和抗氧化等功效[13]。阿魏側(cè)耳胞外多糖是從液體發(fā)酵液中提取的多糖組分[14]，相關(guān)研究目前集中在液體發(fā)酵[14-15]、粗多糖提取[10]及粗多糖的生物活性探索等[10, 16-17]，未有純化組分對(duì)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報(bào)道。本文對(duì)阿魏側(cè)耳發(fā)酵液中的胞外粗多糖進(jìn)行了分離純化，初步研究了阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分的性質(zhì)及其對(duì)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞免疫能力的調(diào)節(jié)作用，為其開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料

阿魏側(cè)耳菌種，中國(guó)科學(xué)院菌種保藏中心;ICR 小鼠，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)SCXK(京)2016—0002)，雄性，5～6 周齡，體重25 g 左右(倫理審查批準(zhǔn)號(hào)為L(zhǎng)FNUSKYLL2020001)；DEAE-52 纖維素，美國(guó)Bio-Rad公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠，GE醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部；F12K培養(yǎng)基，美國(guó)Sigma公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，浙江天杭生物科技股份有限公司；白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒，青島海德誠(chéng)生物工程有限公司；NO熒光探針(4-amino-5-methylamino-2′, 7′-difluorofluorescein diacetate，DAF-FM DA)和活性氧熒光探針(2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，北京碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(Dextran T-10，Dextran T-40，Dextran T-70，Dextran T-500)、MD44透析袋(截留分子質(zhì)量8 kDa)，北京索萊寶科技有限公司；D-甘露糖(D-mannose, Man)、D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid, GlcA)、D-半乳糖醛酸(D-galacturonic acid monohydrate, GalA)、L-鼠李糖(L-rhamnose, Rha)、D-葡萄糖(D-glucose, Glc)、D-半乳糖(D-galactose, Gal)、L-阿拉伯糖(L-arabinose, Ara)和L-巖藻糖(L-fucose, Fuc)，上海麥克林生化科技有限公司；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板和離心管，美國(guó)Corning公司；實(shí)驗(yàn)所需其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

1260 Infinity液相色譜儀(配有G1362A RID示差折光檢測(cè)器和DAD檢測(cè)器)、PL aquagel-OH MIXED-H 凝膠柱、Agilent ZORBAX SB-C18柱，美國(guó)Agilent科技公司；MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱和MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司；UV-1801紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司；iMark酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；Hei-VAp Advantage旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph公司；CKX41SF倒置顯微鏡(配有CCD圖像傳感器DP71及Image-pro plus 圖像分析軟件)、IX71倒置熒光顯微鏡(配有CCD圖像傳感器DP73)，日本Olympus公司；ZHJH-C超凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；ALPHA 1-2 冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Martin Christ 公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、BSD-YX 3600立式智能搖床，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；UNIC-7200型可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿魏側(cè)耳胞外粗多糖的提取

發(fā)酵培養(yǎng)。挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的阿魏側(cè)耳菌絲體，接種于已優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成：透析袋透析后的馬鈴薯浸提液200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L)，25 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)結(jié)束后收集發(fā)酵液，銅網(wǎng)過(guò)濾，4 000 r/min離心20 min，收集上層液體，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃濃縮至原體積的1/10。

醇沉干燥。濃縮后的發(fā)酵液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃醇沉12 h，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，用75 %(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌2次，離心，去上清液體，沉淀用丙酮洗滌2次，離心收集沉淀，冷凍干燥后備用。

復(fù)溶和除蛋白。將醇沉干燥后的阿魏側(cè)耳胞外多糖復(fù)溶于蒸餾水中，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入1/5 體積的Sevag試劑(氯仿-正丁醇，體積比為4∶1)，振蕩30 min，靜置5 h，去除含白色凝膠物質(zhì)的有機(jī)層；重復(fù)4～5次，直至有機(jī)層中無(wú)明顯白色為止。

透析。將除蛋白后的阿魏側(cè)耳胞外多糖溶液，分裝于透析袋(截留分子質(zhì)量8 kDa)中，流水透析24 h，超純水4 ℃透析24 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥后備用。

1.2.2 阿魏側(cè)耳胞外多糖的分離純化

1.2.2.1 DEAE-52 纖維素柱層析

將處理后的 DEAE-52纖維素裝入層析柱(1 cm×20 cm)，調(diào)整流速為1 mL/min，超純水平衡 24 h。將冷凍干燥的阿魏側(cè)耳多糖復(fù)溶于超純水中(10 g/L)，4 000 r/min離心10 min，收集上清5 mL，上樣DEAE-52 纖維素柱，超純水洗脫，流速1 mL/min，自動(dòng)分步收集器收集，苯酚-硫酸法[18]跟蹤檢測(cè)，繪制洗脫曲線并按峰收集，每管5 mL，將收集到的多糖溶液濃縮、冷凍干燥后備用。

1.2.2.2 Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析

將處理后的Sephadex G-100葡聚糖凝膠裝柱(2 cm×60 cm)，調(diào)整流速為0.5 mL/min，平衡和洗脫方法同上。將DEAE-52 纖維素柱層析分離的多糖復(fù)溶(濃度為10 g/L)，針頭濾器(孔徑為0.45 μm)抽濾后，上樣SephedexG-100葡聚糖凝膠柱，超純水洗脫，按照1.2.2.1方法繪制洗脫曲線、按峰收集。將收集的溶液濃縮、冷凍干燥后得到純化的阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分。

1.2.3 阿魏側(cè)耳胞外多糖的分子量測(cè)定

參照范三紅等[7]的高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography, HPGPC)，并適當(dāng)改進(jìn)。將葡聚糖標(biāo)樣和多糖樣品用超純水溶解，濾器(孔徑為0.45 μm)抽濾。色譜條件：Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，Agilent PL aquagel-OH MIXED-H 凝膠柱(7.5 mm×300 mm，8 μm)，檢測(cè)器為Agilent G1362A RID示差折光檢測(cè)器，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相：超純水，流速：0.6 mL/min；標(biāo)準(zhǔn)品為已知分子質(zhì)量的葡聚糖(Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70和Dextran T-500)。將葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成1.0 mg/mL的溶液，按上述條件測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品和多糖樣品的保留時(shí)間，以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品平均分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值lgMw為因變量，保留時(shí)間t為自變量，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，得到一元線性回歸方程，根據(jù)回歸方程，計(jì)算多糖樣品的平均分子質(zhì)量。

1.2.4 阿魏側(cè)耳胞外多糖的單糖組成分析

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)柱前衍生化單糖，高效液相色譜法分離鑒定[16]。在離心管中加入0.05 moL/L單糖混樣100 μL，0.5 mol/L PMP-甲醇溶液100 μL，0.3 mol/L NaOH 100 μL，渦旋混勻，70 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 100 μL，混勻中和，加入蒸餾水1 mL，氯仿2 mL，充分混勻后靜置，棄下層有機(jī)相，重復(fù)萃取3次；濾器(孔徑為0.45 μm)抽濾后，轉(zhuǎn)入樣品瓶中待用，每個(gè)待測(cè)樣品3個(gè)重復(fù)。取阿魏側(cè)耳胞外多糖5 mg，置于安瓿瓶中，加入2 mol/L 三氟乙酸1 mL，酒精噴燈封口，110 ℃水解6 h，冷卻至室溫，加甲醇后真空干燥，重復(fù)操作多次，去除三氟乙酸，0.3 mol/L NaOH調(diào)中性，定容至1 mL。

HPLC條件：Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，檢測(cè)器為Agilent DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，柱溫35 ℃，上樣體積20 μL；流動(dòng)相：A：0.02 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered solution，PBS)，pH 6.0；流動(dòng)相B：乙腈，流速1.0 mL/min；洗脫梯度：0 min，0%B；10 min，18%B；20 min，25%B。

1.2.5 阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分的免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)活性

1.2.5.1 細(xì)胞的收集和培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞的收集采用灌洗腹腔法，參考王晶等[19]方法進(jìn)行。將小鼠頸椎脫臼后，置75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中浸泡1 min，重復(fù)2次后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，無(wú)菌注射F12K培養(yǎng)液至小鼠腹腔，收集含細(xì)胞的腹腔液至離心管中，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀用含10 % FBS(F12K-FBS，體積比為9∶1)F12K培養(yǎng)液重懸后，均勻地接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

淋巴細(xì)胞的收集采用密度梯度離心法，參照小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液的操作說(shuō)明進(jìn)行。按上述方法處死小鼠，取脾臟置75%乙醇中浸泡1 min，PBS漂洗3次，轉(zhuǎn)至F12K培養(yǎng)液中；脾臟一端剪一小口，緩慢擠出細(xì)胞，銅網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液至離心管(預(yù)先加入適量淋巴細(xì)胞分離液)中，2 500 r/min離心20 min，吸取第二層的淋巴細(xì)胞懸液至離心管中，細(xì)胞洗滌液洗滌，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，重復(fù)1次，細(xì)胞用無(wú)血清的F12K培養(yǎng)液重懸后，按上述方法接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5.2 多糖處理

待巨噬細(xì)胞貼壁后，吸棄上層液體，添加無(wú)血清的F12K 培養(yǎng)液，并將細(xì)胞分為多糖處理組和空白對(duì)照組。多糖處理組分別添加終質(zhì)量濃度為10、20 和30 mg/L的無(wú)菌阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分，空白對(duì)照組添加等體積的F12K培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別收集細(xì)胞和上層培養(yǎng)液，熒光探針?lè)y(cè)定細(xì)胞中NO 和活性氧含量；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ的濃度。

將體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞分為多糖處理組和空白對(duì)照組，多糖處理組分別添加終質(zhì)量濃度為10、20和30 mg/L的無(wú)菌阿魏側(cè)耳胞外多糖多糖水提組分，空白對(duì)照組添加等體積的F12K培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定培養(yǎng)上清液中的IL-2和IFN-γ的濃度。

1.2.5.3 NO含量的測(cè)定

熒光探針?lè)?。按照DAF-FM DA 使用說(shuō)明，將NO探針稀釋400倍，添加到不同處理組巨噬細(xì)胞的表面， 37 ℃避光孵育30 min，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡觀察和拍照，軟件IPP分析和測(cè)定平均光密度值(相對(duì)值)[19]。

1.2.5.4 細(xì)胞中活性氧測(cè)定

按照上述方法收集和接種巨噬細(xì)胞，多糖處理24 h。按照活性氧檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，用無(wú)血清F12K培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA探針至終濃度為10 μmol/L，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗后，加入終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA探針，37 ℃恒溫孵育20 min，無(wú)血清的F12K培養(yǎng)液洗滌3次，熒光顯微鏡觀察和拍照，軟件IPP分析和測(cè)定平均光密度值(相對(duì)值)。

1.2.5.5 IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的測(cè)定

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)采用雙抗體一步夾心法[10]。取1.2.5.2細(xì)胞培養(yǎng)液，12 000 r/min離心10 min后收集上清液，按照試劑盒的說(shuō)明操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)A450 nm，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組培養(yǎng)上清中IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ濃度。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏側(cè)耳胞外多糖的分離純化

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基對(duì)阿魏側(cè)耳進(jìn)行液體發(fā)酵，將發(fā)酵液過(guò)濾、離心、濃縮、醇沉干燥、除蛋白、透析(去除分子質(zhì)量小于8 kDa組分)、濃縮和冷凍干燥后得到阿魏側(cè)耳胞外粗多糖。阿魏側(cè)耳胞外粗多糖經(jīng)DEAE-52 纖維素柱分離，以超純水洗脫后，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，得到1個(gè)明顯主峰，洗脫曲線見(jiàn)圖1-A，命名為PFEPw(water extract component of exopolysaccharides fromP.ferulaeLanzi)。將PFEPw收集和冷凍干燥后經(jīng)SephadexG-100葡聚糖凝膠柱進(jìn)一步純化，洗脫曲線見(jiàn)圖1-B，可以看出，PFEPw的洗脫曲線出現(xiàn)4個(gè)獨(dú)立峰，分別命名為PFEPw-1、PFEPw-2、PFEPw-3和PFEPw-4，由于PFEPw-2、PFEPw-3和PFEPw-4組分多糖含量較低，較難收集足夠量進(jìn)行后續(xù)研究，故僅對(duì)PFEPw-1組分進(jìn)行收集、濃縮和冷凍干燥，作為下一步實(shí)驗(yàn)的樣品。

A-DEAE-52 纖維素柱洗脫曲線;B-Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱洗脫曲線圖1 阿魏側(cè)耳胞外多糖經(jīng)DEAE-52 纖維素和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of crude exopolysaccharides from P.ferulae Lanzi by DEAE-52 cellulose column chromatography and Sephadex G-100 column chromatography

2.2 阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分分子質(zhì)量和單糖組成

2.2.1 分子質(zhì)量測(cè)定

采用HPGPC法測(cè)定葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分PFEPw-1的保留時(shí)間(圖2-A)，以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的lgMw為因變量，保留時(shí)間t為自變量進(jìn)行相關(guān)回歸分析，得相關(guān)系數(shù)R=-0.953，P<0.05，表明，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品平均分子質(zhì)量對(duì)數(shù)lgMw與其保留時(shí)間t具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，一元線性回歸方程為：lgMw=-0.926t+17.646。PFEPw-1的保留時(shí)間為13.842 min(圖2-B)，根據(jù)回歸方程計(jì)算其平均分子質(zhì)量為67.3 kDa。

A-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品;B-PFEPw-1圖2 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和PFEPw-1的HPGPC圖Fig.2 HPGPC of standard dextrans and PFEPw-1

2.2.2 單糖組成測(cè)定

將PFEPw-1水解后，采用高效液相色譜法進(jìn)行單糖組成分析。由高效液相色譜結(jié)果(圖3)可知，PFEPw-1由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖組成，各單糖含量比為2.42∶3.90∶2.27∶1.41，其中D-葡萄糖含量最高，L-阿拉伯糖含量最低。

2.3 體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞

參照王晶等[19]方法和小鼠脾淋巴細(xì)胞分離液使用說(shuō)明，分別收集小鼠巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞，建立體外培養(yǎng)體系。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，巨噬細(xì)胞貼壁或半貼壁生長(zhǎng)，形狀不規(guī)則(圖4-A)，脾淋巴細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，圓形(圖4-B)，2種細(xì)胞透光性較好，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)建立的培養(yǎng)體系適合小鼠巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。

A-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞;B-小鼠脾淋巴細(xì)胞圖4 體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞(標(biāo)尺= 100 μm)Fig.4 Murine peritoneal macrophages and spleen lymphocytes cultured in vitro (scale=100 μm)

2.4 阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分對(duì)巨噬細(xì)胞NO和活性氧產(chǎn)生的影響

DAF-FM DA探針和DCFH-DA探針可通過(guò)活細(xì)胞的質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，分別被酯酶水解為DAF-FM和DCFH。DAF-FM和DCFH均無(wú)熒光或有微弱的熒光且不能透過(guò)質(zhì)膜，DAF-FM可與細(xì)胞中的NO結(jié)合，產(chǎn)生綠色熒光，熒光強(qiáng)度或平均光密度顯示活細(xì)胞內(nèi)NO的水平[19]，DCFH則被細(xì)胞內(nèi)活性氧氧化為DCF，產(chǎn)生綠色熒光，熒光強(qiáng)度或平均光密度則可顯示活細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

為研究阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分PFEPw-1對(duì)巨噬細(xì)胞免疫能力的影響，分別用DAF-FM DA探針和DCFH-DA探針標(biāo)記PFEPw-1處理后的巨噬細(xì)胞，IPP軟件測(cè)定相對(duì)平均光密度，結(jié)果顯示，與空白組相比，10～30 mg/L的PFEPw-1處理24 h后，NO熒光探針(圖5和圖6)和活性氧熒光探針(圖6和圖7)的平均光密度值均顯著增加(P<0.05)。說(shuō)明，PFEPw-1處理24 h可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)NO和活性氧的產(chǎn)生。

A-空白對(duì)照組;B-10 mg/L PFEPw-1處理組C-20 mg/L PFEPw-1處理組;D-30 mg/L PFEPw-1處理組圖5 NO 熒光探針標(biāo)記的小鼠巨噬細(xì)胞(標(biāo)尺= 50 μm)Fig.5 Murine macrophage stained by NO fluorescence probe (scale=50 μm)

A-NO熒光的平均光密度值;B-活性氧熒光的平均光密度值圖6 小鼠巨噬細(xì)胞中NO熒光和活性氧熒光的平均光密度值Fig.6 The average optic density of NO fluorescence in murine macrophages in different groups注:*表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)

A-空白對(duì)照組;B-10 mg/L PFEPw-1處理組C-20 mg/L PFEPw-1處理組;D-30 mg/L PFEPw-1處理組圖7 DCFH-DA熒光探針標(biāo)記的小鼠巨噬細(xì)胞(標(biāo)尺= 100 μm)Fig.7 Murine macrophage stained by DCFH-DA fluorescence probe (scale=100 μm)

2.5 阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分對(duì)巨噬細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ分泌量的影響

PFEPw-1處理小鼠巨噬細(xì)胞24 h后，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定其中的多種免疫相關(guān)細(xì)胞因子濃度。結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可檢測(cè)到IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ，其中，TNF-α和IFN-γ的濃度較高，分別為(619.62±10.65) ng/L和(688.62±11.97) ng/L(表1)。與空白對(duì)照組相比，10、20和30 mg/L PFEPw-1處理組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IFN-γ的濃度顯著增加(P<0.05)(表1)；20和30 mg/L PFEPw-1處理組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1和IL-6的濃度顯著增加(P<0.05)(表1)。說(shuō)明，一定添加濃度的PFEPw-1可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌。

表1 阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分對(duì)巨噬細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ分泌量的影響Table 1 Effects of PFEPw-1 on the secretion of IL-1, IL-6, TNF-α and IFN-γ from murine macrophages

相關(guān)研究顯示，TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ和NO是成熟單核細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞后分泌的主要細(xì)胞因子或信號(hào)分子，M1型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生活性氮或活性氧，發(fā)揮機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤細(xì)胞以及病原體增殖功能[20-21]。由此可見(jiàn)，阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分PFEPw-1可能通過(guò)提高巨噬細(xì)胞對(duì)NO和活性氧合成及TNF-α、IL-1、IL-6和IFN-γ的分泌，促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞的成熟，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫能力，這與CHEN等[22]研究結(jié)果一致。

2.6 阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分對(duì)體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-γ分泌量的影響

為研究PFEPw-1對(duì)淋巴細(xì)胞免疫功能的影響，使用小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液無(wú)菌分離脾淋巴細(xì)胞，建立體外培養(yǎng)體系；收集PFEPw-1處理后的脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定其中的IL-2和IFN-γ濃度。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞可分泌IL-2和IFN-γ，2種細(xì)胞因子濃度分別為(365.40±16.85) ng/L和(258.67±5.83) ng/L(表2)。與空白對(duì)照組相比，20和30 mg/L PFEPw-1處理組脾淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)上清中IL-2和IFN-γ濃度顯著增加(P<0.05)，具有濃度依賴性(表2)。說(shuō)明一定添加濃度的PFEPw-1可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)IL-2和IFN-γ的分泌。

表2 阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分對(duì)脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-γ分泌量的影響Table 2 Effects of PFEPw-1 on the secretion of IL-2 and IFN-γ from spleen lymphocytes

IL-2是免疫系統(tǒng)中重要的細(xì)胞因子之一，可促進(jìn)抗體形成、干擾素和腫瘤壞死因子的形成和釋放，具有顯著的免疫增強(qiáng)作用[23]。IFN-γ是由巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧和氮的中間體或多種炎癥因子，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和淋巴細(xì)胞的免疫能力，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能[24]。因此，阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分PFEPw-1可能通過(guò)促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞對(duì)IL-2和IFN-γ的分泌，調(diào)節(jié)脾淋巴細(xì)胞的免疫能力。

相關(guān)研究顯示，多糖的單糖組成和分子質(zhì)量與其免疫調(diào)節(jié)活性有關(guān)，半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖等單糖與多糖的免疫調(diào)節(jié)活性呈正相關(guān)[25]，分子質(zhì)量較大的多糖可能含有較多的高度重復(fù)結(jié)構(gòu)，可以多向性交叉連接質(zhì)膜表面受體，特異性增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)效果[26]。因此，阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分PFEPw-1 可激活體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞，具備較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，可能與其含有較高濃度的半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖以及分子質(zhì)量較大有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究將培養(yǎng)阿魏側(cè)耳菌絲體的發(fā)酵液進(jìn)行離心、濃縮、醇沉、除蛋白、透析、濃縮和冷凍干燥后得到阿魏側(cè)耳胞外粗多糖，再用DEAE-52 纖維素柱層析和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析得到阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分PFEPw-1，平均分子質(zhì)量為64.2 kDa，單糖組成為D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖等，各單糖含量比依次為2.42∶3.90∶2.27∶1.41。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，PFEPw-1可激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中NO和活性氧合成(P<0.05)以及TNF-α、IL-1、IL-6和IFN-γ的分泌(P<0.05)，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞對(duì)IL-2和IFN-γ的分泌(P<0.05)。本研究初步探究了阿魏側(cè)耳胞外多糖水提組分PFEPw-1性質(zhì)及其對(duì)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，為阿魏側(cè)耳胞外多糖的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。