miR-21、miR-221、miR-106a在兒童骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

申子龍 程富禮 張林鋒

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨癌，主要以危害兒童群體為主。在兒童中骨肉瘤發(fā)病率僅次于白血病及淋巴瘤，侵襲性骨肉瘤易出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患兒不良結(jié)局。近年來(lái)外科手術(shù)技術(shù)和化療方案的不斷優(yōu)化，骨肉瘤患兒預(yù)期壽命和生存質(zhì)量有了很大的改善，其5年存活率可達(dá)70%～80%，但化療藥物長(zhǎng)期應(yīng)用所帶來(lái)的并發(fā)癥及耐藥問(wèn)題對(duì)患兒長(zhǎng)期生存帶來(lái)了不利的影響[1-3]。免疫療法是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的癌癥治療方向，微小RNA(miRNA)是一系列長(zhǎng)度大小為18～22個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA分子，參與多種腫瘤的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程。miR21、miR-221、miR-106a均是新發(fā)現(xiàn)的miRNA分子，其中miR-21被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控晚期結(jié)直腸癌、黑色素瘤及子宮內(nèi)膜癌的腫瘤免疫進(jìn)程[4-6]，miR-221被發(fā)現(xiàn)可用于原發(fā)性肝細(xì)胞癌、兒童急性淋巴細(xì)胞白血病及甲狀腺的診斷及預(yù)后評(píng)估[7-9]，此外，miR-106a被證明乳腺癌、胃癌及鼻咽癌的病情判斷具有一定的價(jià)值[10-12]，在骨肉瘤組織中，miR21、miR-221、miR-106a表達(dá)改變及其臨床價(jià)值尚不明確，本研究通過(guò)對(duì)兒童骨肉瘤組織中miR21、miR-221、miR-106a表達(dá)改變及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析，旨在為該病的臨床診療及免疫靶點(diǎn)開發(fā)提供有價(jià)值的研究基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇本院骨科2017年3月至2020年3月收治兒童骨肉瘤患者40例作為研究對(duì)象，術(shù)中收集其病理組織，置于-80 ℃冰箱中凍存，通過(guò)電子病歷調(diào)查收集研究組患者臨床資料，包括性別、年齡、發(fā)病部位、Enneking臨床分期及是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移情況。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)術(shù)中病理診斷為骨肉瘤。②年齡≤14周歲。③均為首次接受治療，術(shù)前未進(jìn)行化療及其他治療。④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①監(jiān)護(hù)人不同意參加研究者。②治療中途退出研究或轉(zhuǎn)院者。③治療中途意外死亡者。選擇同期醫(yī)院收治的多指畸形患者20例其軟骨組織作為對(duì)照組，兩組對(duì)象在性別、年齡等一般資料方面比較無(wú)差異(P>0.05)。

1.2 miR-21、miR-221、miR-106a的免疫組化檢測(cè)

采用免疫組化法檢測(cè)miR-21、miR-221、miR-106a在組織中的表達(dá)情況，具體步驟：保存的骨肉瘤組織經(jīng)常規(guī)石蠟切片后，經(jīng)過(guò)烘干、脫蠟、水化、檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)后，使用PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，滴加3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS緩沖液沖洗后滴加山羊抗體進(jìn)行孵育，快速甩干后滴加分別滴加miR-21、miR-221、miR-106a抗體(北京中杉金橋公司)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS緩沖液沖洗后向組織切片滴加二抗，37 ℃孵育30 min，采用DAB試劑盒(武漢博士德公司)顯色5 min，沖洗干凈后蘇木精復(fù)染3min，清洗干凈，梯度酒精進(jìn)行脫水，二甲苯透明3 min，晾干后使用中性樹膠進(jìn)行封片。

1.3 結(jié)果判定

染色完成后由病理科經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞染色特征進(jìn)行分類，未著色細(xì)胞標(biāo)記為陰性，淡黃色、棕黃色細(xì)胞為陽(yáng)性標(biāo)志。根據(jù)切片的陽(yáng)性細(xì)胞比例及著色深度進(jìn)行計(jì)分，以半定量法統(tǒng)計(jì)結(jié)果，視野下陽(yáng)性細(xì)胞百分率判定：0分：>5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：>75%。陽(yáng)性細(xì)胞著色深度判定：0分：無(wú)色或與背景色重疊，1分：淺棕黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色，將細(xì)胞陽(yáng)性百分率判定得分與著色深度判定得分相乘結(jié)果為免疫組化染色評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兒童骨肉瘤組織及正常軟骨組織中miR-21、miR-221、miR-106a的表達(dá)比較

免疫組化分析結(jié)果表明，兒童骨肉瘤組織中miR-21、miR-221、miR-106a的相對(duì)表達(dá)顯著高于正常軟骨組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兒童骨肉瘤組織及正常軟骨組織中miR-21、miR-221、miR-106a的表達(dá)比較

2.2 骨肉瘤組織miR-21、miR-221、miR-106a表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

骨肉瘤組織miR-21、miR-221、miR-106a表達(dá)與Enneking臨床分期及肺轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡及發(fā)病部位無(wú)關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 miR-21、miR-221、miR-106a表達(dá)與骨肉瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 骨肉瘤組織中miR-21、miR-221、miR-106a表達(dá)對(duì)骨肉瘤的預(yù)測(cè)價(jià)值

多元Logistic回歸分析結(jié)果表明，在校正性別、年齡、發(fā)病部位和肺轉(zhuǎn)移等混雜性因素后，miR-21、miR-221、miR-106a水平升高仍是骨肉瘤發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

表3 骨肉瘤組織中miR-21、miR-221、miR-106a表達(dá)對(duì)骨肉瘤的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，OS在20歲以下青少年及兒童中發(fā)病率約3.2/1 000 000，其中男性發(fā)病率明顯高于女性。肺轉(zhuǎn)移是影響OS患兒預(yù)后的主要不利因素，發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的患兒生存率可由65%～70%降低至19%～30%，在未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移前對(duì)該病的防治較為困難[13-14]。目前研究認(rèn)為OS發(fā)病原因包括表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和CAK激酶組配因子(menage a trois，MAT1)等腫瘤突變累積、年齡、性別、激素水平及輻射暴露等與OS發(fā)病存在緊密關(guān)聯(lián)，而免疫因素則是導(dǎo)致OS發(fā)病的主要深層次原因[15-16]。

以免疫調(diào)節(jié)劑、巨噬細(xì)胞活化劑和樹突狀細(xì)胞治療等為代表的免疫靶向治療在OS中已有一定的應(yīng)用，但其臨床療效不一，因此需開發(fā)新的分子靶點(diǎn)，用于OS的臨床治療。miRNA在體內(nèi)發(fā)揮的免疫功能具有多效性，對(duì)腫瘤存在雙向調(diào)控作用，且對(duì)機(jī)體對(duì)于化療藥物的敏感性存在一定的影響。miR-21主要位于染色體17q23.2上，既往研究證實(shí)了miR-21可與PTEM、TPM1、PDCD4等基因相結(jié)合的方式影響腫瘤的發(fā)展過(guò)程[17-18]。miR-221定位于X染色體P11.3上，主要通過(guò)與miR-222結(jié)合的方式影響下游免疫反應(yīng)，并最終對(duì)腫瘤的增殖過(guò)程產(chǎn)生影響[19]。miR-106a屬于miR-17家族，屬于miR-106a-363基因簇中的重要致癌部分，研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a可通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的方式影響腫瘤的發(fā)展并參與腫瘤耐藥過(guò)程[20]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-221、miR-106a mRNA在骨肉瘤細(xì)胞中水平顯著上調(diào)[21-22]，本研究調(diào)查了miR-21、miR-221、miR-106a兒童骨肉瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示與正常軟骨組織相比，骨肉瘤組織中miR-21、miR-221、miR-106a的表達(dá)顯著增加，表明miR-21、miR-221、miR-106a可能參與了兒童骨肉瘤的發(fā)病過(guò)程。本研究分析了骨肉瘤組織miR-21、miR-221、miR-106a表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明，miR-21、miR-221、miR-106a均在Enneking臨床分期為ⅡB、Ⅲ期水平高于I、IIA期水平，而發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，其骨組織中miR-21、miR-221、miR-106a也明顯高于未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，提示miR-21、miR-221、miR-106a可能與兒童骨肉瘤的病程發(fā)展及骨轉(zhuǎn)移有關(guān)。

骨肉瘤的確診及臨床分期、病理學(xué)分型等的確定需要借助病理科專業(yè)人員的幫助，存在一定的主觀性，而受限于檢查條件、醫(yī)師水準(zhǔn)等因素的限制，骨肉瘤診斷的不準(zhǔn)確、不及時(shí)可能造成病情延誤的問(wèn)題。本研究結(jié)果證明了miR-21、miR-221、miR-106a可能參與了兒童骨肉瘤的疾病發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。