miR-300通過(guò)下調(diào)ROCK1降低肝癌細(xì)胞增殖和分化的研究

貢旭楠 饒艷偉

肝癌是一種最常見的惡性腫瘤，在癌癥的死亡率中排在第二位。肝癌的誘因包括遺傳因素、慢性病毒感染、非酒精性脂肪肝、吸煙和長(zhǎng)期酗酒等，而且會(huì)持續(xù)影響肝癌的轉(zhuǎn)歸，但其分子作用機(jī)制至今還不清楚。臨床治療肝癌的主要方法包括：手術(shù)治療、化療和肝移植等，治療后存在生存率低和轉(zhuǎn)移的情況。mi RNAs是一種沒有編碼的RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸組成，可以直接靶向3’-UTR mRNA，引起mRNA的降解和抑制翻譯過(guò)程，在細(xì)胞中扮演著調(diào)控基因表達(dá)的作用。研究證明miRNAs是癌癥發(fā)生、發(fā)展的主要調(diào)控基因，功能為致癌基因或抑癌基因，調(diào)控細(xì)胞的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究顯示在肝癌中存在很多的miRNAs功能紊亂，其可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程。研究顯示miR-300在肝癌組織和細(xì)胞中存在高表達(dá)，但是也有研究表明其低表達(dá)[1-4]?，F(xiàn)階段針對(duì)miR-300在肝癌中的分子作用機(jī)制還不明確，影響的下游目的基因還不清楚。因此，本研究針對(duì)miR-300對(duì)肝癌的分化、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制做進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑

miR-300 mimic(The sequences of miR-300 were as follows：Sense，5'-UAU ACA AGG GCA GAC UCU CUC U-3'；anti-sense，5'-AGA GAG AGU CUG CCC UUG UAU A-3'.)；miR-300 引物：5'-TAT ACA AGG GCA GAC TCT CTC T-3'(Forward)，U6：5'-CGC AAG GAT GAC ACG CAA ATT CGT-3'(Reverse)；ROCK1引物：5’-AGGA AGGCGGACATATTAGTCCCT-3’(Forward)，5’-AGAC GATAGTTGGGTCCCGGC-3’ (Reverse)；GAPDH 引物：5'-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3'(Forward)，5'-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3'(Reverse)；pcDNA3.1 Vector訂購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific，Inc.；ROCK1蛋白抗體訂購(gòu)于Abcam。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞HepG2、Huh-7和人正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞為吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。HepG2和Huh-7細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并保持一定的濕度。所有細(xì)胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)肝癌組織和細(xì)胞中的miR-300和ROCK1的表達(dá)水平

根據(jù)TRIzol試劑盒(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.)提取組織和細(xì)胞中總RNA，依照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit 試劑盒(Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.) 在如下條件16 °C，30 min；42 °C，30 min；85 °C，5 min。cDNA合成通過(guò)Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase 試劑盒(Takara Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China) 條件：37 °C，15 min；72 °C，10 min，qPCR 擴(kuò)增采用Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.)條件：95 °C，10 min；40 個(gè)循環(huán)：95 °C 15 s和 60 °C，60 s。

1.4 Western Blot檢測(cè)HepG2和Huh-7細(xì)胞中ROCK1蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，Bio-Rad法測(cè)定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書步驟操作，測(cè)定樣品的蛋白濃度。用Image J圖像處理軟件計(jì)算各條豆類灰度值，分析ROCK1蛋白表達(dá)情況。目的蛋白與內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的灰度值的比值進(jìn)行描述表達(dá)情況。

1.5 MTT檢測(cè)HepG2和Huh-7細(xì)胞增殖率

按使用說(shuō)明書用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)法檢測(cè)細(xì)胞生存能力。全自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)570 nm)測(cè)定各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Sub-G0/G1值

肝癌HepG2和Huh-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-300 mimic后，收集細(xì)胞，加入70%的乙醇，通過(guò)碘化丙啶(PI，200 mg/ml)固定，之后通過(guò)Aria Ⅱ sorter流式細(xì)胞儀分析(BD Biosciences)，每組計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)出Sub-G0/G1值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測(cè)肝癌組織和細(xì)胞中miR-300和ROCK1的表達(dá)水平

與正常組織相比，肝癌組織中miR-300的表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)，如圖1A，ROCK1的表達(dá)水平明顯增加(P<0.001)如圖1C。與人正常肝細(xì)胞HL-7702相比，肝癌細(xì)胞HepG2和Huh-7中miR-300的表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)，如圖1B，ROCK1的表達(dá)水平明顯增加(P<0.001)如圖1D。

圖1 RT-qPCR檢測(cè)肝癌組織和細(xì)胞中miR-300和ROCK1的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染miR-300 mimic后，HepG2和Huh-7細(xì)胞中ROCK1的表達(dá)

與Scrambled Control相比，qPCR結(jié)果表明miR-300 mimic組的ROCK1的表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)，如圖2A、C。Western blot結(jié)果表明miR-300 mimic組的ROCK1的表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)，如圖2B、D。

圖2 qPCR和Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞ROCK1表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染miR-300 mimic后，MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2和Huh-7細(xì)胞增殖率和Sub-G0/G1比值

MTT結(jié)果表明：HepG2和Huh-7細(xì)胞隨著miR-300 mimic作用時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.001)，圖3A；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明：與Scrambled Control相比，miR-300 mimic組的Sub-G0/G1比值水平明顯增加(P<0.001)，圖3B。

圖3 MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2和Huh-7細(xì)胞增殖率和Sub-G0/G1比值

3 討論

針對(duì)miR-300的研究還比較少，在腫瘤組織中的作用還存在歧義。本研究發(fā)現(xiàn)miR-300在肝癌組織和細(xì)胞中存在低表達(dá)，Xinye Zhang[1]、Yufo Chen[5]和RongchangWang[2]的研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，但是Junkai Zhang[3]的研究證明miR-300在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)增高，其研究結(jié)果與本研究相反。因此，本研究證實(shí)了miR-300在肝癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，與大多數(shù)研究結(jié)果一致，具有可信度。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)ROCK1的表達(dá)明顯增加，與miR-300呈負(fù)相關(guān)。為了證明miR-300是否通過(guò)影響ROCK1的表達(dá)，給予miR-300模擬物轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)能降低肝癌細(xì)胞HepG2和Huh-7中的ROCK1的基因和蛋白水平的表達(dá)，因此研究證實(shí)了可以通過(guò)提高miR-300表達(dá)來(lái)降低ROCK1的表達(dá)來(lái)影響肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，同時(shí)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖和分化能力發(fā)現(xiàn)miR-300模擬物作用在36 h后細(xì)胞增殖率下降，特別是在48 h后有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在48 h細(xì)胞的Sub-G0/G1比值顯著增加，說(shuō)明肝癌細(xì)胞停止增殖和分化。在Fucheng Zhou[4]的研究中發(fā)現(xiàn)miR-300可以通過(guò)抑制ROCK1的表達(dá)來(lái)影響腦膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)歸，其研究的作用機(jī)制與本研究一致。

綜上，本研究證實(shí)了miR-300可以通過(guò)抑制ROCK1影響肝癌的增殖和分化，miR-300有可能作為肝癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。