基于1H-NMR肝臟代謝組學(xué)的白芍抗抑郁作用研究

李添，李肖，田俊生，高曉霞，秦雪梅，周玉枝

(山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006)

抑郁癥作為一種常見的精神類疾病，以情緒低落、思維遲緩為臨床表現(xiàn)，重度抑郁還會出現(xiàn)失眠，幻覺甚至有自殺行為。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)通過溫和且不可預(yù)測的模仿引起人類壓力應(yīng)激源來誘發(fā)動物產(chǎn)生抑郁行為，與人類抑郁癥的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制更接近，是目前藥理實驗中常見的抑郁模型之一[1]?，F(xiàn)代研究針對該模型的研究主要集中在海馬、額葉皮質(zhì)和紋狀體等中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2-3]，而其對肝組織的研究也必不可少。中醫(yī)理論認(rèn)為治療抑郁癥應(yīng)當(dāng)從疏肝解郁入手，肝主疏泄且肝臟是調(diào)節(jié)情志的主要器官，肝氣順，則人體的氣血運行通暢；肝氣郁結(jié)，人體氣血受阻[4]。因此，深入探索抑郁癥對肝臟組織產(chǎn)生的影響對于解釋抑郁癥的發(fā)病機(jī)理至關(guān)重要。

白芍是毛茛科白芍屬植物，酸寒收斂，養(yǎng)血柔肝，常與其他藥味共同組成疏肝解郁復(fù)方。賀妮等[5]證明白芍提取物對抑郁癥有較好的改善作用，可能是通過作用于單胺遞質(zhì)系統(tǒng)抑制炎癥因子相關(guān)靶點而產(chǎn)生抗抑郁和抗炎作用。白芍的主要化學(xué)成分包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等，王景霞等[6]發(fā)現(xiàn)白芍提取物(芍藥苷48.89 %和芍藥內(nèi)酯苷18.99 %)具有抗抑郁作用，對中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有調(diào)節(jié)作用并能明顯改善嗅球損毀大鼠的行為活動。然而，關(guān)于白芍是否通過調(diào)節(jié)CUMS大鼠的肝組織代謝輪廓從而發(fā)揮抗抑郁作用尚沒有文獻(xiàn)研究。

基于核磁共振技術(shù)的代謝組學(xué)，可利用動植物樣本的核磁共振譜圖，充分展示小分子代謝物的信息，通過對這些信息多元統(tǒng)計分析和模式識別處理[7]，了解相關(guān)代謝物的動態(tài)變化并揭示它們對于機(jī)體整體的生物學(xué)意義。在對抑郁癥CUMS模型的研究中，相比于抑郁樣行為學(xué)分析，代謝組學(xué)技術(shù)更能反映內(nèi)在機(jī)制[8-9]。因此本文通過行為學(xué)指標(biāo)結(jié)合1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)來綜合評價白芍對CUMS大鼠肝臟代謝輪廓的調(diào)節(jié)作用，從而揭示其抗抑郁的作用機(jī)理,實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程圖

1 材料

1.1 試劑與儀器

蔗糖(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DHG-9050B恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實驗設(shè)備有限公司)；RV 10 digital V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國艾卡集團(tuán))；BRUKER 600 MHz AVANCE III超導(dǎo)核磁共振波譜儀(瑞士)；TGL-16高速臺式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 實驗藥品

白芍(批號：1710436111，產(chǎn)地：安徽)藥材飲片購于河北安國市祁澳中藥飲片有限公司；鹽酸文拉法辛膠囊(規(guī)格：25 mg/粒，批號：130101，廠家：成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200 ± 20)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～24 ℃，室內(nèi)相對濕度45%～55%，明暗交替周期12 h。動物實驗獲得山西大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：SXULL2016036)。

1.4 白芍提取制備

稱取適量白芍藥材飲片，用8倍量70%乙醇浸泡1 h后回流提取2次，每次2 h，合并提取液，靜置、過濾、旋轉(zhuǎn)濃縮、冷凍干燥，制成細(xì)粉，儲存于-20 ℃冰箱備用。藥物使用前用蒸餾水超聲溶解為溶液。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

按照體質(zhì)量、曠場實驗、糖水偏愛實驗結(jié)果，選擇指標(biāo)相近的大鼠60只，將其隨機(jī)分為空白組，模型組，陽性藥組(文拉法辛，35 mg·kg-1)，白芍低、高劑量組(生藥量15、30 g·kg-1)，給藥組按照大鼠體質(zhì)量10 mL·kg-1灌胃給藥，空白、模型組給予同等量的蒸餾水。

2.2 CUMS抑郁模型的復(fù)制

動物適應(yīng)7 d后，空白組大鼠正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何刺激，其余各組大鼠裝入單籠喂養(yǎng)，并按照前期實驗室建立的建模程序重建慢性不可預(yù)測的輕度應(yīng)激(CUMS)模型。為了確保刺激因素的不可預(yù)測性，隨機(jī)安排每日刺激，并保證各項刺激不連續(xù)出現(xiàn)，且發(fā)生的總數(shù)不應(yīng)超過4次，該過程持續(xù)28 d[10]，包括：禁水、禁食(各24 h)；熱刺激10 min；超聲刺激(60 W，3 h)；足底電擊(持續(xù)2 s，間隔10 s，共10次)；冰水游泳(4 ℃，高50 cm，直徑20 cm有機(jī)玻璃缸)；晝夜顛倒；束縛3 h。

2.3 行為學(xué)測試

2.3.1 體質(zhì)量

在實驗的第0、1、2、3、4周對大鼠進(jìn)行稱量。

2.3.2 曠場測試(OFT)

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者均符合臨床關(guān)于白內(nèi)障的診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)眼壓檢查、房角檢查或B超檢查確診;(2)年齡>60歲;(3)患者意識清晰、交流能力正常;(4)知曉實驗?zāi)康?簽署《知情同意書》。

利用曠場實驗[11]評估大鼠的運動和空間探索能力，在實驗開始的第0、1、2、3、4周進(jìn)行。實驗裝置由100 cm2(25個相等正方形)的黑色區(qū)域組成，周圍是高40 cm的黑色墻壁。將大鼠緩慢地放到裝置的中心，適應(yīng)1 min，探索4 min，觀察測試期間每只大鼠的穿越橫格數(shù)雙肢離開地面1 cm的直立次數(shù)。每次測試后，用10%的酒精清洗曠場設(shè)備，以消除殘留的氣味。

2.3.3 糖水偏愛實驗(SPT)

根據(jù)文獻(xiàn)[11]報道，在第0和28天進(jìn)行糖水偏愛測試。實驗前，將大鼠單獨飼養(yǎng)，并提供兩瓶1%的蔗糖水以適應(yīng)蔗糖溶液。在最初的24 h內(nèi)放入兩瓶1%的蔗糖水，在接下來的24 h，用日常飲用水替換其中一瓶1%的蔗糖水。經(jīng)過上述糖水偏愛率訓(xùn)練后，所有動物被剝奪食物和水12 h，然后大鼠自由選擇飲用蔗糖水或水12 h。根據(jù)消耗量計算出大鼠的糖水偏愛率糖水偏愛率(%)=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+飲用水消耗量)×100%。

2.3.4 強(qiáng)迫游泳實驗(FST)

參考前期文獻(xiàn)[11]，在測試前1天，將大鼠放入水深30 cm、溫度(25±1)℃的玻璃圓筒(直徑20 cm，高50 cm)中，進(jìn)行15 min預(yù)測試以消除水引起的急性壓力。預(yù)測試24 h后，進(jìn)行5 min的強(qiáng)迫游泳。不動時間被定義為當(dāng)大鼠僅進(jìn)行微妙的必要動作且其頭部保持在水上時狀態(tài)的時間。

2.4 肝組織樣本的收集

水合氯醛麻醉大鼠后進(jìn)行腹主動脈取血，快速收集肝組織并立刻置于液氮中，并在-80 ℃冰箱冷凍保存以待進(jìn)行核磁分析。

2.5 代謝組學(xué)樣品制備及測定

收集每只大鼠的肝臟外側(cè)葉組織約200 mg，加入600 μL甲醇，300 μL超純水于冰水浴中勻漿；在13 000 r/min和4 ℃下離心20 min，收集上清液，氮氣流吹干，于600 μL D2O磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH=7.4，含0.010 % TSP)中渦旋復(fù)溶后，在13 000 r/min和4 ℃下離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移到5 mm NMR管中用于分析。

2.6 1H-NMR譜圖數(shù)據(jù)處理與分析

1H-NMR圖譜處理使用MestReNova(6.1.1版，Mestrelab Research，Santiagode Compostella，西班牙)進(jìn)行處理。對每張核磁圖譜進(jìn)行相位和基線手動校正，以TSP的化學(xué)位移δ 0.00為標(biāo)準(zhǔn)，切除δ4.62～5.17區(qū)間的水峰，對δ0.75～8.56范圍的核磁圖譜以0.01為單位進(jìn)行積分和總峰面積歸一化，產(chǎn)生數(shù)據(jù)矩陣。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將矩陣導(dǎo)入Excel表格中，采用SIMCA-P 13.0軟件(Umetrics公司，瑞典)進(jìn)行主成分分析(PCA)觀察樣本整體分布情況，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)用于檢查各組之間的趨勢，并對建立的模型進(jìn)行排列檢驗，排列檢驗是對R2(模型擬合度)和Q2(預(yù)測能力)的計算，V-S-plot圖結(jié)合VIP>1及t檢驗(P<0.05)作為篩選潛在生物標(biāo)志物條件。使用生物學(xué)數(shù)據(jù)庫HMDB(http://www.hmdb.ca)進(jìn)行代謝物的鑒定，并使用MetaboAnalyst網(wǎng)頁(https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行代謝通路分析。SPSS 25.0軟件用于進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，通過t檢驗比較兩組之間的統(tǒng)計學(xué)差異；one-way ANOVA比較多組之間的統(tǒng)計學(xué)差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 行為學(xué)測試

3.1.1 體質(zhì)量實驗

第4周模型組大鼠的體質(zhì)量顯著降低(P<0.001)，表明CUMS造模成功；給藥后，陽性藥組(P<0.01)、白芍低劑量組(P<0.001)的體質(zhì)量均發(fā)生顯著性增加(見表1)，表明白芍能有效逆轉(zhuǎn)CUMS造模引起的體質(zhì)量減輕。

3.1.2 曠場實驗

第4周模型組大鼠的穿越格數(shù)和直立次數(shù)都顯著減少(P<0.001，P<0.001)；給藥后，陽性藥組(P<0.001)、白芍低劑量組(P<0.01)的穿越格數(shù)均顯著增加(見表1)；陽性藥組(P<0.01)、白芍高低劑量組(P<0.05，P<0.05)的直立次數(shù)也有顯著增加(見表1)。結(jié)果表明，白芍能夠改善抑郁大鼠的曠場活動情況。

3.1.3 糖水偏愛實驗

第4周模型組大鼠糖水偏愛率顯著性減少(P<0.001)，給藥后，陽性藥組(P<0.001)、白芍低劑量組(P<0.05)的糖水偏愛率均顯著增加(見表1)。結(jié)果表明，白芍能顯著逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠的快感缺失現(xiàn)象。

3.1.4 強(qiáng)迫游泳實驗

第4周模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動時間顯著增加(P<0.001)。給藥后，陽性藥組(P<0.001)、白芍低劑量組(P<0.05)的不動時間均顯著減少(見表1)，結(jié)果說明白芍能有效逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠的行為絕望現(xiàn)象。

3.2 1H-NMR代謝組學(xué)

3.2.1 核磁圖譜歸屬

1H-NMR譜圖如圖2，結(jié)合文獻(xiàn)[12]報道和 HMDB(http://www.hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫對圖譜進(jìn)行分析，共指認(rèn)出42種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，結(jié)果如表2。

表1 第4周造模后大鼠行為學(xué)指標(biāo)

表2 大鼠肝臟樣本1H-NMR數(shù)據(jù)歸屬

圖2 空白組大鼠肝臟樣本1H-NMR圖譜

3.2.2 多元統(tǒng)計分析

根據(jù)1H-NMR 圖譜成分歸屬獲得的肝臟內(nèi)源性代謝物信息，首先采用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)方法，從PCA得分圖及3D圖可以發(fā)現(xiàn)空白組和模型組能明顯分開(圖3A、3B)；為了驗證模型的可靠性，構(gòu)建PLS-DA模型圖(圖3C)，所有左側(cè)排列均低于右側(cè)原始值且相交于負(fù)半軸 (R2X=0.741、R2Y=0.987、Q2=0.947)，即為CUMS模型重建成功、可靠。進(jìn)而采用有監(jiān)督的OPLS-DA，以篩選出與抑郁癥相關(guān)的差異變量。OPLS-DA得分圖顯示空白組和CUMS模型組可明顯分開(圖3D)，結(jié)合V-S-plot圖中VIP>1、P(corr)≥0.58且≤-0.58及t檢驗(P<0.05)篩選空白組與CUMS組的差異變量(圖3E)。對空白組、模型組、陽性藥組、白芍高、低劑量組進(jìn)行OPLS-DA分析，可以看出各組間能清楚分離(圖3F)，說明各給藥組對篩選出的肝臟差異代謝物的調(diào)節(jié)程度不同。

注：A.空白組與模型組PCA得分圖；B.PCA-3D得分圖；C.PLS-DA模型驗證圖；D.OPLS-DA散點圖；E.V-S-plot圖；F.各組OPLS-DA散點圖圖3 多元統(tǒng)計分析圖

3.2.3 差異代謝物分析

由OPLS-DA分析結(jié)果篩選出24個與抑郁相關(guān)的生物標(biāo)志物，相較于空白組大鼠，模型組大鼠肝臟中尿囊素、α-葡萄糖、β-葡萄糖、膽堿、甜菜堿、二甲基甘氨酸、甘油和氧化型谷胱甘肽8種代謝物含量升高；醋酸鹽、丙氨酸、肌酸、二甲胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、次黃嘌呤、異亮氨酸、亮氨酸、低密度脂蛋白、賴氨酸、丙酮酸、酪氨酸、鄰磷酸膽堿和纈氨酸16種代謝物含量降低。給藥后結(jié)果分析，白芍低劑量組能夠顯著回調(diào)與抑郁相關(guān)的全部差異代謝物，而白芍高劑量組能顯著回調(diào)其中除甘氨酸、鄰磷酸膽堿之外的22種代謝物。綜上可見，白芍高、低劑量組對肝臟中與抑郁相關(guān)的差異代謝物均有顯著回調(diào)作用。見圖4。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖4 各組大鼠肝臟差異代謝物的變化

3.2.4 代謝通路分析

將上述24種與抑郁癥相關(guān)的以及白芍能顯著回調(diào)的差異代謝物輸入metaboanalyst網(wǎng)頁中進(jìn)行代謝通路分析。橫坐標(biāo)Pathway impact表示代謝通路重要值，縱坐標(biāo)-log(p)表示通路富集分析的P值水平。本研究以代謝通路重要值(impact value)>0.1以及代謝通路富集水平(-log p)>2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到10條與抑郁相關(guān)的代謝通路(圖5)，分別為a：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝；b：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成；c：甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的代謝；d：丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝；e：丙酮酸代謝；f：酪氨酸代謝；g：谷胱甘肽代謝：h：糖酵解/糖異生；i：精氨酸的生物合成；j：乙醛酸酯和二羧酸酯代謝。代謝通路分析發(fā)現(xiàn)白芍能調(diào)節(jié)CUMS模型影響的10條代謝通路。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對與抑郁癥相關(guān)的10條代謝通路及所涉及的生物標(biāo)志物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析(圖6)，可見各代謝通路與生物標(biāo)志物之間相互關(guān)聯(lián)，證明了抑郁癥發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性及白芍整體性調(diào)節(jié)的特點。

注：A.抑郁相關(guān)代謝通路；B.白芍調(diào)節(jié)代謝通路圖5 肝臟代謝通路的MetPA分析

注：空白組相比，紅色字體代表模型組上調(diào)的代謝物，藍(lán)色字體代表模型組下調(diào)的代謝物；與模型組相比，紅色箭頭代表白芍組代謝物顯著增加，藍(lán)色箭頭代表白芍組代謝物顯著減少。圖6 抑郁癥相關(guān)的10種代謝通路的代謝網(wǎng)絡(luò)

4 討論

白芍味苦、酸，性微寒，功能養(yǎng)肝血、補(bǔ)肝陰、抑肝陽，為養(yǎng)血柔肝，維持正常情志活動的要藥。四逆散、枳實芍藥散、柴胡疏肝散、逍遙散等歷代疏肝解郁的名方中，皆以白芍為主藥；現(xiàn)代中醫(yī)對于抑郁癥的臨床治療，無論在組方頻次和用藥劑量上，白芍也都占有重要的位置[6]。

本研究將CUMS模型大鼠視為研究對象，白芍給藥后，行為學(xué)指標(biāo)得到顯著改善，表明白芍具有明確的抗抑郁藥效，運用核磁代謝組學(xué)技術(shù)鑒定出肝臟中24種與抑郁相關(guān)的差異代謝物，白芍干預(yù)后能回調(diào)全部的代謝物，代謝通路富集分析也表明白芍可以通過改善10條代謝通路發(fā)揮抗抑郁作用。其中谷氨酸作為一種已知的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其含量發(fā)生異常會誘發(fā)神經(jīng)毒性[13]。谷氨酸的生成途徑主要有兩條，分別是谷氨酰胺經(jīng)谷氨酰胺酶作用發(fā)生的轉(zhuǎn)化以及丙氨酸通過丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶發(fā)生的轉(zhuǎn)化，谷氨酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的肝臟谷氨酸含量顯著降低，代謝通路分析結(jié)果也表明CUMS造?？梢鸫笫蟾闻K中谷氨酸代謝發(fā)生紊亂，而白芍干預(yù)后都有所改善，表明白芍可改善谷氨酸在體內(nèi)的代謝紊亂情況，從而起到抗抑郁效果。

谷胱甘肽(GSH)是人體組織中含量最豐富的抗氧化劑，是抗氧化能力以及氧化應(yīng)激的關(guān)鍵指標(biāo)，有研究表明，谷胱甘肽系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常會降低谷氨酸NMDA受體的谷氨酸能活性，減弱神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的產(chǎn)生，從而影響認(rèn)知與情感[14]。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS 模型可引起大鼠體內(nèi)氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的升高，說明抑郁模型削弱了大鼠肝組織中抵御氧化應(yīng)激的能力，當(dāng)給予抑郁大鼠白芍后，大鼠體內(nèi)GSSG的含量有所降低，提示白芍可以通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力發(fā)揮抗抑郁作用。

甘氨酸是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的競爭性配體，當(dāng)甘氨酸結(jié)合到選擇性甘氨酸結(jié)合位點時，可間接增強(qiáng)NMDA 受體激動后所產(chǎn)生的生理效應(yīng)，而NMDA 受體的過度激活被認(rèn)為是抑郁癥發(fā)生的重要原因之一[15]。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS 造模大鼠與正常大鼠相比，其肝臟中甘氨酸的含量顯著降低，白芍給藥后改善這一情況，可能與上述機(jī)理有關(guān)。

綜上所述，本研究從內(nèi)源性代謝物及代謝通路的角度，探索了白芍抗抑郁的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)白芍對CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠發(fā)生的肝臟代謝紊亂有明顯改善作用，其發(fā)揮抗抑郁作用涉及多條代謝通路，但各差異性代謝物與抑郁癥的內(nèi)在聯(lián)系以及相關(guān)代謝通路的驗證仍需要進(jìn)一步考察。