高效液相色譜法測定鹽酸嗎啉胍片含量及其不確定度評定

朱清麗，李 鵬，郭夢倩，涂蓉榮

（1.陜西省安康市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 安康725000；2.陜西省安康市中心醫(yī)院，陜西 安康725000）

鹽酸嗎啉胍片（又名病毒靈）現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［1－2］采用紫 外－可見分光光度（UV）法測定鹽酸嗎啉胍的含量。為了進(jìn)一步提高檢測標(biāo)準(zhǔn)，本研究中參考文獻(xiàn)［3－8］，建立了測定含量的高效液相色譜（HPLC）法。并根據(jù)李慎安《化學(xué)實(shí)驗室測量不確定度》、倪育才《實(shí)用測量不確定度評定（第5版）》及參考文獻(xiàn)［9－12］分析新建方法含量測定結(jié)果的不確定度，找出了不確定度的主要來源并判定所建方法測定結(jié)果的可信度?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－2030型高效液相色譜儀（含紫外檢測器、色譜工作站）、UV－2600型紫外分光光度計，均購自日本Shimadzu公司；Milli－Q Integral 5型超純水一體機(jī)（德國默克密理博公司）；AUW220D型電子分析天平（精度為十萬分之一）；KQ－250DE型超聲波清洗儀（昆山市超聲波儀器廠）。

1.2 試藥

鹽酸嗎啉胍片（山西太原藥業(yè)有限公司，批號為191006，181102；山西津華暉星制藥有限公司，批號為191113）；鹽酸嗎啉胍對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100483－200402，含量100.00%）；甲醇、磷酸二氫鉀均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Phoenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2 mol／L磷酸二氫鉀溶液－甲醇（95∶5，V／V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：237 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 溶液制備

取鹽酸嗎啉胍對照品50 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取2 mL，置200 mL容量瓶中，加水定容，制成每1 mL中含10 μg的對照品溶液。取樣品20片，研細(xì)，稱取適量，精密稱定（約相當(dāng)于鹽酸嗎啉胍50mg），置100mL容量瓶中，加水適量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理20 min，加水定容，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容，制成每1 mL中約含10 μg的供試品溶液。取按鹽酸嗎啉胍片處方工藝制備不含鹽酸嗎啉胍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性與系統(tǒng)適用性試驗：分別精密量取2.2項下3種溶液各20 μL，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰，陰性對照無干擾。分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.moroxydine hydrochlorideA.Negative reference solution B.Reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

檢測限與定量限考察：取2.1.2項下對照品溶液，逐級定量稀釋后，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以信噪比（S／N）為10∶1時的測得值為定量限，以S／N為3∶1時的測得值為檢測限，結(jié)果鹽酸嗎啉胍的定量限為0.017 7 μg／mL，檢測限為0.005 78 μg／mL。

耐用性試驗：取2.1.2項下對照品溶液及供試品溶液，分別在不同流速（0.8，1.0，1.2 mL／min）、不同柱溫（30，35，40℃）、不同色譜柱（Phenomenex C18柱，Agilent C18柱，InertSustain C18柱）下進(jìn)樣分析（均保持其余色譜參數(shù)不變），結(jié)果表明，流速、柱溫或色譜柱發(fā)生一定程度改變時，本方法能滿足試驗要求，耐用性好。

線性關(guān)系考察：精密量取對照品貯備液1，3，5，7，9，10 mL，分別置50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻；各精密量取5 mL置50 mL容量瓶中，定容，制成系列對照品溶液。各精密量取20 μL，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X，μg／mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝89 011.0X－447.346，r＝0.999 9（n＝6）。結(jié)果表明，鹽酸嗎啉胍質(zhì)量濃度在2～20 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密量取對照品溶液20 μL，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為191006）適量，依法制備供試品溶液，室溫下放置0，2，6，8，12，24 h，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.27%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為191006）粉末適量，按

2.1.2 項下方法制備供試品溶液，平行6份，分別精密量取20 μL，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果的RSD為0.40%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為191006）粉末適量，平行9份，精密稱定，分別精密加入2.1.2項下對照品貯備液8，10，12 mL，各3份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別精密量取20 μL，并按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n＝9）

2.1.4 樣品含量測定

取各批次樣品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，各平行4份，分別精密量取20 μL，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并計算含量。結(jié)果平均含量為97.29%，詳見表2。將表2數(shù)據(jù)與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的UV法的含量測定結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果批號為191006，181102，191113樣品含量測定結(jié)果，UV法均高于HPLC法（99.16%比96.98%，98.86%比96.99%，99.72%比97.89%）。

表2 樣品中鹽酸嗎啉胍含量測定結(jié)果（n＝4）Tab.2 Content determination of moroxydine hydrochloride in the samples（n＝4）

2.2 不確定度評定

2.2.1 模型計算方法

2.2.2 主要來源

不確定度的主要來源包括隨機(jī)效應(yīng)與系統(tǒng)效應(yīng)導(dǎo)致的分量。隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的分量有人員的操作分散性，儀器的穩(wěn)定性、重復(fù)性，試樣制備處理及環(huán)境等若干隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度。系統(tǒng)效應(yīng)導(dǎo)致的分量有儀器、玻璃量器的允許誤差，對照品的純度及試驗溫度等由系統(tǒng)效應(yīng)引入的不確定度。新建方法測量結(jié)果的不確定度主要來源有人員操作偏向性，試樣制備處理，儀器測量的穩(wěn)定性、重復(fù)性，天平、玻璃量器最大允許誤差，環(huán)境溫度等。

2.2.3 分量計算

1）重復(fù)性

把整個檢測過程中隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的分量，如人員操作偏向性，試樣制備處理，儀器測量的穩(wěn)定性、重復(fù)性等隨機(jī)效應(yīng)帶來的不確定度分量的分析，以重復(fù)性表示。取本實(shí)驗室內(nèi)4名實(shí)驗人員按新建方法及測量條件檢測鹽酸嗎啉胍片含量的試驗結(jié)果20份，根據(jù)測量結(jié)果計算其殘差Vk，詳見表3。計算出合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差Sp。20份樣品的平行試驗結(jié)果差值的平均值為：

表3 樣品的測量結(jié)果和殘差計算Tab.3 Results of content determination of moroxydine hydrochloride in the samples and calculation of its residual error

按貝賽爾公式計算標(biāo)準(zhǔn)差s（Δk）：

平行試驗2次的平均值q的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差：

自由度：v＝m－1＝19，W＝97.63%。則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2）對照品溶液校正因子（f）的不確定度分析

（1）對照品取樣量的相對不確定度urel（mR）：稱量所使用的天平為萬分之一及十萬分之一的雙量程電子天平，在d＝0.01 mg檔，檢定證書給出天平示值誤差為0.03 mg，按 矩 形 分 布，0.017 mg，采用減重法稱定質(zhì)量，則天平校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)不確 定 度 為。對 照 品 稱 定 質(zhì) 量 為10.41 mg，則urel（mR）＝0.024／10.41＝0.002 3。

（2）對照品稀釋體積的相對不確定度urel（VR）：①第1次，試驗中應(yīng)選用檢定為A級的容量瓶進(jìn)行定量分析。A級的100 mL容量瓶最大允許誤差為±0.10mL，按矩形分布；本試驗中溫度為23℃，校準(zhǔn)溫度為20℃，按矩形分布，則。則②第2次，A級的5 mL單標(biāo)線移液管最大允許誤差為±0.015 mL，按矩形分布環(huán)境溫度變化對玻璃儀器帶來影響，移液管的校準(zhǔn)溫度為20℃，本試驗中溫度為23℃，則由此產(chǎn)生的體積變化分散區(qū)間半寬a＝5×3×2.1×10－4mL，按矩形分布 ，則u2（VR2）＝0.003 mL。則urel（VR2）＝③第3次，A級的50 mL容量瓶最大允許誤差為±0.05 mL。參照第1次稀釋評定，則

（3）對照品峰面積的不確定度urel（AR）：使用的高效液相色譜儀為自動進(jìn)樣系統(tǒng)，其進(jìn)樣體積帶來的不確定度可忽略不計。2份對照品平行進(jìn)樣2次，峰面積分別為926 563，926 714，942 352，942 766，平均值分別為926 638.5和942 559，采用極差法評定，R分別為151，414，查表，n＝2時，得極差系數(shù)C＝1.13，則s（A）分別為133.628和366.372，則

（4）對照品校正因子（f）的合成不確定度：Urel（f）＝3.13×10－3。對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，含量為100%，其帶來的不確定度可忽略不計。天平稱量與稀釋體積測量的重復(fù)性，已納入1）重復(fù)性評定中，不再進(jìn)行計算。

3）樣品含量測定的不確定度分析

（1）供試品稱樣量的相對不確定度urel（m）：天平重復(fù)性已納入重復(fù)性評定中，不再進(jìn)行計算。采用減重法稱量供試品，根據(jù)天平檢定證書的數(shù)據(jù)，電子天平在d＝0.1 mg檔時天平示值誤差為0.01 mg。按矩形分布，u（m）＝，則天平校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。供試品稱樣量為0.0763g＝76.3 mg，則urel（m）＝0.008 1／76.3＝1.06×10－4。

（2）樣品稀釋體積（V）帶入的不確定度：①第1次，同對照品首次稀釋方法評定，urel（V1）＝5.46×10－4。②第2次，2 mL單標(biāo)線移液管（A級）的最大允許誤差為±0.010 mL，按矩形分布0.005 8 mL。本試驗中溫度為23℃，移液管的校準(zhǔn)溫度為20℃，則由此產(chǎn)生的體積變化分散區(qū)間半寬a＝2×3×2.1×10－4mL，按矩形分布，則u2（V2）＝0.001 3 mL。則V2的 合 成 標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 為 ：urel（V2）＝。③第3次，同第1次的稀釋方法評定

（3）供 試 品 峰 面 積 的 相 對 不 確 定 度urel（A）：按2.2.3的2）項的（3）項下方法評定，2份樣品平行進(jìn)樣2次，峰面積為922 233，921 883，918 553，918 390，則u1（A）＝241.602 2／920 264.75＝2.63×10－4。

2.2.4 不確定度分量

結(jié)果見表4。

表4 各種不確定度分量匯總Tab.4 Summary of the weight of various uncertainty

2.2.5 合成不確定度及擴(kuò)展不確定度計算

合成不確定應(yīng)根據(jù)相對不確定分量合成后求得，

擴(kuò)展不確定度：取包含因子為k＝2，置信水平為95%，U＝2×0.43%＝0.86%，鹽 酸嗎啉胍片 含量測定結(jié)果為W＝（97.0±0.86）%（k＝2）。

3 討論

3.1 檢測方法建立

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用UV法，為直接測定方式，雖方法簡便，但準(zhǔn)確性較低、專屬性不強(qiáng)。HPLC法通過色譜柱進(jìn)行分離，分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高，可大幅提高檢測的準(zhǔn)確度、專屬性。

3.2 檢測波長選擇

預(yù)試驗中分別將各溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果在237 nm波長處均有最大吸收，輔料在237 nm波長處無吸收，故選擇237 nm為測定波長。

3.3 流動相選擇

常用庚烷磺酸鈉溶液－甲醇－乙腈作為類似研究的流動相，考慮到離子對試劑會對色譜柱造成永久性的改性，離子試劑體系重復(fù)性不佳，離子對試劑在流動相和色譜柱之間的平衡時間較長等因素，故嘗試用甲醇－水、乙腈－水、乙腈－磷酸二氫鉀流動相系統(tǒng)，結(jié)果均不理想。采用本流動相后，檢測到的鹽酸嗎啉胍理論板數(shù)均大于5 000，保留時間、分離度、重復(fù)性、拖尾因子結(jié)果均滿意。流動相比例考察：預(yù)試驗中流動相考察了0.2 mol／L磷酸二氫鉀溶液－甲醇（85∶15，90∶10，93∶7，94∶6，V／V），結(jié)果兩者比例為85∶15和90∶10時分離結(jié)果均不理想，比例為93∶7和94∶6時理論板數(shù)及拖尾因子不如比例為95∶5時，故采用0.2 mol／L磷酸二氫鉀溶液－甲醇（95∶5，V／V）作為流動相。

3.4 不確定度評定

HPLC法測定樣品含量不確定度，各影響因素按相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由大到小分別為對照品校正因子、移液管體積、樣品稀釋體積、樣品峰面積、重復(fù)性、樣品取樣量。對照品校正因子不確定度中各分量按相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由大到小分別為對照品取樣量、移液管體積、對照品稀釋體積、對照品峰面積，其中主要來源是對照品取樣量較小，在操作過程中應(yīng)盡量選擇穩(wěn)定性好、精密度高、天平示值誤差小的天平，同時適當(dāng)加大對照品取樣量。從移液管體積、稀釋體積分析得出，玻璃量器體積越小，帶來的不確定度越大，故應(yīng)盡可能選擇體積較大的玻璃量器。在日常工作中要注意對儀器的維護(hù)保養(yǎng)、檢定校準(zhǔn)及期間核查，使儀器保持良好的工作狀態(tài)。加強(qiáng)對檢測人員的培訓(xùn)，規(guī)范試驗操作流程，提高工作能力，減小操作誤差。