靈芝超微粉對大鼠的長期毒性研究*

羅 玲，賀宗毅，韋，李 卿，楊 軔

（1.重慶市南岸區(qū)南山街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，重慶400065；2.重慶市中藥研究院，重慶400065；3.重慶市大足區(qū)婦幼保健計劃生育服務(wù)中心，重慶402360）

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoderma sinenseZhao，Xu et Zhang的干燥子實體，味甘、性平，歸心、肺、肝、腎經(jīng)［1］，具有補氣安神、止咳平喘功效，臨床多用于心神不寧、肺虛咳嗽、虛勞短氣、不思飲食等證?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，其具有多種生物活性，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)文將靈芝作為新的藥食同源物料來源，極大地推動了靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。超微粉碎技術(shù)通過機械或流體動力的途徑將物料顆粒粉碎至微米級甚至納米級微粉的過程。中藥材活性成分主要存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞在完整無損情況下，活性成分只有穿透細(xì)胞壁才能發(fā)揮作用。經(jīng)過超微粉碎工藝，可使直徑10～100 μm的中藥細(xì)胞破壁率超過90%。中藥超微粉既保留了傳統(tǒng)飲片的優(yōu)點，又兼具一般顆粒所不具備的特殊理化性質(zhì)，如良好的溶解性、分散性、吸附性、生物活性等［2－9］。超微粉中藥來自天然藥材的超微粉碎，其溶出度高于普通粉，安全性可能與普通粉不完全相同［10－14］。通過靈芝超微粉長期喂飼大鼠實驗，全方位地評價其服用的安全性，對大鼠血液學(xué)及血液生化學(xué)的影響已有報道。本研究中擬介紹靈芝超微粉長期喂飼對大鼠免疫學(xué)、尿液、眼科、臟器質(zhì)量及系數(shù)的影響，為科學(xué)、合理應(yīng)用靈芝提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：ST－360型酶標(biāo)儀（上?？迫A試驗系統(tǒng)有限公司）；AM－4290型尿液分析儀（日本京都第一科學(xué)儀器廠）；YZ11型檢眼鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司）；KJ5S1型手持裂隙燈顯微鏡（蘇州工業(yè)園區(qū)康捷醫(yī)療器械有限公司）；BX53型生物顯微鏡、CX31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：總膽固醇（TC）試劑盒（批號為AUZ3408）、三酰甘油（TG）試劑盒（批號為AUZ4213）、肌酸激酶（CK）試劑盒（批號為9509），均購自貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；免疫球蛋白E（IgE）試劑盒（批號為20170801A）、CD3試劑盒（批號為20170801A）、CD4試劑盒（批號為20170801A）、CD8試劑盒（批號為20170801A），均購自上海繼錦化學(xué)科技有限公司；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號為908M031）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

藥物：靈芝超微粉（重慶純芝生物科技有限公司）經(jīng)重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.的干燥子實體。超微粉碎粒徑為150～400 nm，含靈芝多糖4.5%、三萜及甾醇0.68%。

動物：SPF級SD大鼠，雌性，6～7周齡，體質(zhì)量130.3～192.1 g，60只；雄 性，6～7周 齡，體 質(zhì) 量167.2～226.2 g，60只。均由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供，動物生產(chǎn)許可證為SCXK（渝）2012－0006，實驗動物合格證號為No.0004635；動物使用許可證號為SYXK（渝）2012－0003。飼養(yǎng)溫度為20.4～24.5℃，相對濕度為49%～69%；實驗設(shè)施經(jīng)重慶市實驗動物質(zhì)量檢測中心檢測，符合GB 14925－2010標(biāo)準(zhǔn)中屏障環(huán)境要求。SPF大鼠維持喂養(yǎng)飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 方法

分組與給藥：將120只SD大鼠按體質(zhì)量隨機分為靈芝超微粉高、中、低劑量組（B組、C組、D組，給予生藥8.4，4.2，2.1g／kg）及溶劑對照組（A組，等體積水），各30只，雌雄各半，分開飼養(yǎng)。灌胃給藥，每天2次，連續(xù)91 d。

檢測指標(biāo)：分別于給藥結(jié)束后（D91，n＝10）及給藥結(jié)束30 d后（D121，n＝5）檢測大鼠免疫學(xué)指標(biāo)，包括CD3，CD4，CD8，IgE。尿液指標(biāo)，包括尿液外觀、比重（SG）、pH、尿糖（GLU）、尿蛋白（PRO）、膽紅素（BIL）、尿膽原（URP）、酮體（KET）、潛血（BLD）、白細(xì)胞（LEU）；等級區(qū)分，①外觀，“－”表示淺黃，澄清；②GLU（mmol／L），－（Normal）、±（50）、＋1（100）、＋2（200）、＋3（500）、＋4（1 000）；③PRO（g／L），－（neg.）、±（15）、＋1（30）、＋2（100）、＋3（300）、＋4（1 000）；④BIL（μmol／L），－（neg.）、＋1（0.5）、＋2（2）、＋3（6）、＋4（over）；⑤URO（μmol／L），－（Normal）、＋1（2）、＋2（4）、＋3（8）、＋4（over）；⑥pH，－（5.0和5.5）、±（6.0和6.5）、＋1（7.0和7.5）、＋2（8.0和8.5）、＋3（≥9.0）；⑦SG，－（＜1.005）、±（1.010）、＋1（1.015）、＋2（1.020）、＋3（1.025）、＋4（≥1.030）；⑧BLD（mg／L），－（neg）、±［溶血＋1（0.06）］、＋1［溶血＋＋（0.2）］、＋2［溶血＋3（1.0）］、＋3（非溶血＋1）、＋4（非溶血＋2、＋3）；⑨KET（mmol／L），－（neg.）、±、＋1（15）、＋2（40）、＋3（80）、＋4（150）；⑩LEU（Leu／μL），－（neg.）、±（25）、＋1（75）、＋2（250）、＋3（500）。眼科指標(biāo)，包括眼瞼、眼球、結(jié)膜、角膜、虹膜、瞳孔、眼底等。組織病理學(xué)指標(biāo)，包括心、肝、脾、肺、腎、生殖系統(tǒng)、胃腸道、給藥部位等各臟器或組織大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析，行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表4。免疫學(xué)指標(biāo)影響方面，與A組比較，C組雌性大鼠給藥結(jié)束后的CD4水平顯著升高（P＜0.05），其余各組無顯著差異（P＞0.05）。尿液指標(biāo)的影響方面，給藥結(jié)束后及給藥結(jié)束30 d后，各組大鼠各指標(biāo)無顯著差異（P＞0.05）。眼科指標(biāo)的影響方面，給藥結(jié)束后及給藥結(jié)束30 d后，各組大鼠眼科相關(guān)指標(biāo)，包括眼前節(jié)（眼瞼、眼眶、眼球、淚腺）、眼后節(jié)（結(jié)膜、角膜、前房、房水）、眼外觀（玻璃體、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)乳頭、血管、黃斑）等檢查均未異見異常（P＞0.05）。臟器質(zhì)量、臟器系數(shù)的影響方面，與A組比較，B組雄性大鼠給藥結(jié)束后的胸腺質(zhì)量及系數(shù)均顯著減少／降低，腎上腺系數(shù)顯著升高（P＜0.05）；D組雄性大鼠給藥結(jié)束后的肝臟系數(shù)顯著降低（P＜0.05），其余組大鼠的臟器質(zhì)量及系數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。恢復(fù)期結(jié)束，各組無顯著差異。

表1 靈芝超微粉（D91）對大鼠免疫學(xué)的影響（±s，n＝10）Tab.1 Effect of Ganoderma ultra－fine powder（D91）on immunology of rats（±s，n＝10）

表1 靈芝超微粉（D91）對大鼠免疫學(xué)的影響（±s，n＝10）Tab.1 Effect of Ganoderma ultra－fine powder（D91）on immunology of rats（±s，n＝10）

注：與A組比較，*P＜0.05。表3、表4同。Note：Compared with those in group A，*P＜0.05，as well as Tab.3 and Tab.4.

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表4 靈芝超微粉對大鼠臟器系數(shù)的影響（±s，g／100 g）Tab.4 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on organ coefficient of rats（±s，g／100 g）

表4 靈芝超微粉對大鼠臟器系數(shù)的影響（±s，g／100 g）Tab.4 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on organ coefficient of rats（±s，g／100 g）

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病理學(xué)影響方面，肉眼觀察，給藥結(jié)束后，B組、C組、D組大鼠心、肝、脾、肺、腎、生殖系統(tǒng)、胃腸道、給藥部位等各臟器或組織大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地均未見與樣品相關(guān)的異常改變；給藥結(jié)束30 d后，個別雄性大鼠解剖時觀察到腸道明顯脹氣，其余動物肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、生殖系統(tǒng)、胃腸道、給藥部位等各臟器或組織大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地均未見與樣品相關(guān)的異常改變；組織病理學(xué)檢查，靈芝超微粉生藥8.4 g／kg連續(xù)給藥3個月及恢復(fù)1個月結(jié)束，各臟器組織包括肝、心、脾、肺、腎、腦（大腦、小腦、腦干）、腎上腺（雙側(cè)）、胸腺、脊髓（頸椎、中段胸椎、腰椎）等病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果顯示病理改變均為大鼠偶發(fā)或自發(fā)輕微病變，與給藥無明顯相關(guān)性。

表2 靈芝超微粉對雄性大鼠尿液指標(biāo)的影響（雄／雌，只）Tab.2 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on urine indexes of male rats（male／female，rat）

表3 靈芝超微粉對大鼠臟器質(zhì)量的影響（±s，g）Tab.3 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on organ weight of rats（±s，g）

表3 靈芝超微粉對大鼠臟器質(zhì)量的影響（±s，g）Tab.3 Effect of Ganoderma ultra－fine powder on organ weight of rats（±s，g）

注：D91 A組1只雄性大鼠肝指標(biāo)異常，未納入統(tǒng)計。Note:On D91，one male rat in group A had abnormal liver indexes，which were not included in the statistics.

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3 討論

本研究結(jié)果顯示，SD大鼠連續(xù)91 d（2次／天）灌胃靈芝超微粉生藥8.4，4.2，2.1 g／kg，在停藥后恢復(fù)30 d時，各組雄、雌性大鼠免疫學(xué)指標(biāo)無明顯差異，尿液、眼科、臟器質(zhì)量及系數(shù)相關(guān)指標(biāo)未見明顯異常，綜合長期喂飼雄、雌性大鼠血液學(xué)、血液生化學(xué)檢查試驗結(jié)果，均未見與藥物相關(guān)的異常改變。

超微粉碎技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥飲片、制劑（單味藥材及復(fù)方配伍）領(lǐng)域，已在中藥領(lǐng)域顯示出獨特的優(yōu)勢［15－17］，但在實際應(yīng)用中存在一些問題，需加強正確引導(dǎo)和科學(xué)評價中藥超微粉（制劑）及其進入人體后的安全性問題等［18］。

中藥材超微粉碎適應(yīng)了現(xiàn)代社會快節(jié)奏生活的需求，但由于中藥材品種多，分類廣，應(yīng)按藥材性質(zhì)及特征選擇合適的加工方法，加強物質(zhì)基礎(chǔ)、藥效學(xué)及毒理學(xué)研究，特別是安全性的規(guī)范評價，為臨床應(yīng)用提供參考。