大黃素對(duì)急性肺損傷模型大鼠的保護(hù)作用*

朱麗華，王，彭信言，章忠明△，李激文

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530021；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市工人醫(yī)院急診科，廣西 柳州545005）

急性肺損傷（ALI）是以肺泡－毛細(xì)血管壁損傷、肺水腫和炎性細(xì)胞募集為特征的綜合征，表現(xiàn)為肺內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，肺毛細(xì)血管的高通透性和臨床肺水腫［1］。水通道蛋白（AQP）屬膜水運(yùn)輸?shù)鞍?，AQP4為其中通透性最強(qiáng)的蛋白［2］，在肺、胃腸器官和腎臟的星形膠質(zhì)細(xì)胞、骨骼肌和上皮細(xì)胞的足突中均有表達(dá)［3］。核因子（NF）－κB在炎癥調(diào)節(jié)中起重要作用，而炎性反應(yīng)在ALI的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵性作用［4］。大黃素存在于各種中草藥，有抗腫瘤、抗炎等多種作用［5］。本研究中探討了大黃素對(duì)急性肺損傷模型大鼠肺組織中炎性細(xì)胞因子、AQP4和NF－κB表達(dá)水平的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：CKX53型倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）；MK－3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）；GEMPremier300型全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x（美國Jinkou公司）。

試藥：大黃素（上海吉至生化科技有限公司，批號(hào)為518－82－1）；蘇木素－伊紅（HE）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)為AR1180）；白細(xì)胞介素試劑盒（IL－1β，IL－6，北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)分別為ARB12155，ZN2880－GPK）；腫瘤壞死因子－α（TNF－α）試劑盒（武漢亞科因生物科技有限公司，批號(hào)為AbbkineKET9007）；RIPA裂解液及BCA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為R0020，PC0020）；AQP4抗體、p－NF－κBp65抗體、NF－κBp65抗體、GAPDH抗體和IgG－HRP抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號(hào)分別為59678S，3033S，8242S，5174S，7074S）。

動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠40只（廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2020－0003），雄性，8～10周齡，體質(zhì)量（180±20）g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房（使用許可證號(hào)：SYXK桂2020－004），自由獲取食物和水。適應(yīng)環(huán)境1周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、大黃素低劑量組和大黃素高劑量組，各10只。除對(duì)照組外，另3組大鼠經(jīng)尾靜脈注射油酸（0.1 mL／kg）溶液以復(fù)制急性肺損傷模型。12 h后，從大鼠尾動(dòng)脈抽取0.2 mL血液監(jiān)測(cè)氧合指數(shù)（PaO2／FiO2），若PaO2／FiO2≤300，提示建模成功；對(duì)照組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。建模成功后，大黃素低、高劑量組大鼠分別給予大黃素10，20 mg／kg灌胃，其余組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續(xù)14 d。

1.3 觀察指標(biāo)

動(dòng)脈血血?dú)夥治觯耗┐谓o藥2 h后，大鼠每100 g體質(zhì)量經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.1 mg麻醉，抽取腹主動(dòng)脈血液，采用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x檢測(cè)pH、動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）和PaO2／FiO2。

肺組織濕干質(zhì)量比（W／D）：取大鼠部分肺組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗表面的血液后擦拭干表面水分，稱定質(zhì)量，即為濕質(zhì)量（W）；置真空干燥箱內(nèi)烘烤22 h后稱定質(zhì)量，即為干質(zhì)量（D）；計(jì)算W／D。

肺組織病理學(xué)：摘除大鼠右下肺葉，以10%甲醛溶液固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并制成5 μm厚石蠟切片，HE染色，用中性樹膠封片，鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。采用Smith評(píng)分法對(duì)肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜形成分別評(píng)分，計(jì)0～4分。無損傷為0分；病變范圍＜25%為1分；病變范圍25%～50%為2分；病變范圍50%～75%為3分；病變滿視野為4分；每組選取10個(gè)高倍（400倍）顯微鏡視野，取其平均值，計(jì)算肺組織學(xué)評(píng)分。

肺泡灌洗液中炎性因子：取大鼠左肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。左肺中注入2.5 mL 0.9%氯化鈉溶液，沖洗2～3次后，放入無菌容器中。將肺泡灌洗液在4℃以1 000g離心10 min，分離，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法，以酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處依序測(cè)定吸光度（OD）值，根據(jù)OD值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肺泡灌洗液中IL－1β，IL－6，TNF－α計(jì)算的含量。

肺組織中AQP4和p－NF－κB蛋白表達(dá)：采用Western blotting法檢測(cè)。取肺組織樣品，加RIPA裂解液提取總蛋白，以BCA法測(cè)定總蛋白含量。樣品經(jīng)變性后上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉（5%脫脂奶粉，1 h），加一抗孵育［AQP4抗體（1∶1 000）、p－NF－κBp65抗體（1∶1 000）、NF－κBp65抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶2 000），4℃過夜］，清洗3次，加二抗孵育［對(duì)應(yīng)一抗種屬來源的IgG－HRP標(biāo)記的二抗（1∶3 000），室溫1 h］回收二抗，清洗3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑，將PVDF膜放入暗盒，壓上X膠片，取出膠片后顯影定影、清洗。采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)動(dòng)脈血?dú)獾挠绊?/h3>

與對(duì)照組比較，模型組大鼠各動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)均明顯升高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鲋当容^（±s，n＝10）Tab.1 Comparison of arterial blood gas analysis values of rats ineach group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鲋当容^（±s，n＝10）Tab.1 Comparison of arterial blood gas analysis values of rats ineach group（±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。下圖同。1 mmHg＝0.133 kPa。Note：Compared with those in the control group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with those in the model group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；as well as the following figures.1 mmHg＝0.133 kPa.

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2.2 對(duì)肺組織W／D值的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織W／D明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠肺組織W／D明顯降低（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織W／D值比較Fig.1 Comparison of W／D ratio of lung tissues of rats in each group

2.3 對(duì)肺組織病理學(xué)的影響

對(duì)照組大鼠肺組織均未顯示肺間質(zhì)水腫、出血、充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且肺結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠肺組織均出現(xiàn)損傷，肺間質(zhì)水腫、肺結(jié)構(gòu)破壞、出血、充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；大黃素低、高劑量組大鼠肺組織的肺間質(zhì)水腫、肺結(jié)構(gòu)破壞、出血和充血，以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯改善。詳見圖2 A。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織學(xué)評(píng)分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠肺組織學(xué)評(píng)分均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖2 B。

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)比較A.Lung histopathology B.Lung histological scoreFig.2 Comparison of lung histopathology of rats in each group

2.4 對(duì)肺泡灌洗液中炎性因子水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL－1β，IL－6，TNF－α水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組大鼠比較，大黃素低、高劑量組大鼠肺泡灌洗液中IL－1β，IL－6，TNF－α水平均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 各組大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平比較A.IL－1β B.IL－6 C.TNF－αFig.3 Comparison of inflammatory factors levels in BALF of rats in each group

2.5 對(duì)肺組織中蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中AQP4和p－NF－κBp65蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達(dá)水平比較A.Protein band B.Statistical dataFig.4 Comparison of AQP4 protein expression levels in lung tissues of rats in each group

圖5 各組大鼠肺組織中p－NF－κBp65蛋白表達(dá)水平比較A.Protein band B.Statistical dataFig.5 Comparison of p－NF－κBp65 protein expression levels in lung tissues of rats in each group

3 討論

病原體、毒素、感染、自身免疫因素等均可誘發(fā)ALI。研究表明，急性炎癥和氧化應(yīng)激與ALI的發(fā)生有關(guān)［6］。臨床治療ALI主要采用保護(hù)性肺通氣和使用糖皮質(zhì)激素，但療效欠佳。油酸因建模簡(jiǎn)單且成功率高［7］被廣泛用于復(fù)制ALI模型。

黃天鵬等［8］的研究表明，ALI伴TNF－α，IL－6，IL－1β，IL－23等促炎細(xì)胞因子的釋放［8］。聶進(jìn)等［9］研究發(fā)現(xiàn)，ALI組大鼠肺泡灌洗液中TNF－α和IL－1β的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL－1β，TNF－α，IL－6水平相較對(duì)照組均明顯升高。

AQP又稱水孔蛋白，是位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，可維持肺泡、肺間質(zhì)及肺毛細(xì)血管間的水平衡，在清除肺泡內(nèi)多余液體過程中起主導(dǎo)作用［10］。LI等［11］研究發(fā)現(xiàn)，抑制AQP4可減輕輻射誘發(fā)模型小鼠肺損傷，這與炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)減弱，以及促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生及M2巨噬細(xì)胞的激活均受抑制有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高。

NF－κB屬核轉(zhuǎn)錄因子，參與炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、腫瘤生長(zhǎng)等多種過程，其信號(hào)途徑的活化在ALI發(fā)病機(jī)制中起重要作用［12］。李莉等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在ALI組大鼠肺組織中NF－κBp65的磷酸化程度增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠肺組織中p－NF－κBp65蛋白表達(dá)水平明顯升高，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

大黃素具有多種生物學(xué)功能，包括抗炎、抗癌、免疫抑制、抗病毒特性等［14］。大黃素還可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，抑制ERK1／2和p38 MAPK在成纖維樣滑膜細(xì)胞中的表達(dá)。此外，李劍等［15］等的研究表明，大黃素可抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，下調(diào)分泌蛋白SDF1和CXCR4的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃素可升高大鼠動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)，降低肺W／D，下調(diào)炎性細(xì)胞因子、AQP4表達(dá)及抑制NF－κB信號(hào)通路的活性；其中以高劑量大黃素的效果更好。

綜上所述，大黃素能降低急性肺損傷模型大鼠肺W／D，抑制AQP4表達(dá)、NF－κB信號(hào)通路的活性及炎性因子的釋放，緩解肺組織病理性損傷。該研究可為臨床治療ALI提供參考。