參仙片治療骨質(zhì)疏松癥作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

申麗莎，楊，蔣成英，張安琪，楊巧虹

（1.重慶市中藥研究院，重慶400061；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院·重慶市藥物過(guò)程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121；3.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心，重慶401147）

骨質(zhì)疏松癥是以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)損壞而導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性骨病。該病屬中醫(yī)“骨痿”“骨痹”范疇，證候分布特點(diǎn)以“腎精虧損”為主［1］，臨床多采用補(bǔ)腎益精類中藥及其復(fù)方治療。參仙片由淫羊藿、女貞子、仙茅、人參和制何首烏5味中藥材組方，有溫腎益精、補(bǔ)氣養(yǎng)心功效［2－3］。本研究中利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)［4］，構(gòu)建參仙片治療骨質(zhì)疏松癥的藥物成分與靶點(diǎn)及調(diào)控的通路網(wǎng)絡(luò)，為該藥臨床用于骨質(zhì)疏松癥的治療提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

有效成分篩選：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http：／／tcmspw.com／），以人參、女貞子、仙茅、淫羊藿為關(guān)鍵詞，檢索其有效成分。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，查找制何首烏的活性成分，利用PubChem網(wǎng)站（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）獲取各活性成分的SMILES式，導(dǎo)入SwissADME平臺(tái)（http：／／www.swissadme.ch／），最終收集得符合條件的有效成分。

有效成分相關(guān)靶點(diǎn)收集：利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的Related Targets，PubChem，Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）對(duì)有效成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出每味中藥有效成分的潛在靶點(diǎn)，再通過(guò)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot（https：／／www.uniprot.org／）將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一基因名稱。

潛在靶點(diǎn)獲取：利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.genecards.org／），以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索并匯總，得到骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)靶點(diǎn)，再通過(guò)微生信（http：／／www.bioinformatics.com.cn／）在線作圖工具，將參仙片與骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析

利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“藥物－成分－潛在靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)，并分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，得到主要有效成分及靶點(diǎn)關(guān)系。將參仙片的潛在靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／string－db.org／），以 物 種homo sapiens，combined score＞0.4為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到潛在靶點(diǎn)的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.3 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

利 用David 6.8.0數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：／／david.ncifcrf.gov／summary.jsp），對(duì)參仙片治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。

1.4 成分－靶點(diǎn)分子對(duì)接

從Rcsb數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：／／www.rcsb.org／）中 下 載PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前三的關(guān)鍵靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)：AKT1（PDB ID：6HHH），白細(xì)胞介素6（IL－6，PDB ID：1ALU），TP53（PDB ID：2VUK），綜 合 運(yùn) 用PyMol和AutoDock Tools 1.5.6軟件完成分子對(duì)接及相關(guān)的可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 有效成分篩選與作用靶點(diǎn)確定

共篩選出參仙片有效成分68個(gè)，其中有57個(gè)化學(xué)成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配到404個(gè)靶點(diǎn)（刪除重復(fù)值后）。

2.2 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)4 441個(gè)，將參仙片中的作用靶點(diǎn)與骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得共同靶點(diǎn)259個(gè)（見(jiàn)圖1）。表明參仙片可能通過(guò)多個(gè)潛在作用靶點(diǎn)協(xié)同治療骨質(zhì)疏松癥。

圖1 參仙片活性成分靶點(diǎn)與骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)映射Fig.1 Mapping between targets of active ingredients in Shenxian Tablets and osteoporosis－related targets

2.3 “中藥－有效成分－潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.8.2軟件將5種中藥、57個(gè)化學(xué)成分和259個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理（見(jiàn)圖2）。該網(wǎng)絡(luò)共有409個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 576條邊，該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的平均degree為7.706 6，接近中心值（BC）平均值0.005 6，緊密度中心性（CC）平均值為0.308 7。其中，有23個(gè)活性成分的degree，BC，CC均高于平均值。排名前三的化合物分別為quercetin，moupinamide，citreorosein，推測(cè)這3個(gè)成分是參仙片防治骨質(zhì)疏松癥的主要活性成分。

圖2 參仙片治療骨質(zhì)疏松癥的“藥物－成分－潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig.2″Drug－component－potential target″network of Shenxian Tablets in the treatment of osteoporosis

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將參仙片與骨質(zhì)疏松癥的259個(gè)共同靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限定為“homo sapiens”，選取minimun required interaction score＞0.4，探尋靶基因相互作用間的作用關(guān)系（見(jiàn)圖3）。該網(wǎng)絡(luò)涉及257個(gè)節(jié)點(diǎn)、5 408條邊，其中節(jié)點(diǎn)表示靶基因，邊表示靶基因間的相互作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果表明，節(jié)點(diǎn)degree均值為42.25。根據(jù)節(jié)點(diǎn)數(shù)值高于2倍degree平均值篩選出29個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（見(jiàn)圖4），并認(rèn)為這些靶點(diǎn)對(duì)參仙片防治骨質(zhì)疏松癥起到了關(guān)鍵作用。按degree排列，排名前三的靶點(diǎn)分別為AKT1，IL－6，TP53，可認(rèn)為這是核心靶點(diǎn)。

圖3 參仙片治療骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of Shenxian Tablets in the treatment of osteoporosis－related targets

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of key targets

2.5 靶點(diǎn)的GO功能富集分析

將參仙片的259個(gè)潛在靶點(diǎn)錄入David數(shù)據(jù)庫(kù)，以P＜0.05為篩選條件，共得到GO富集條目1 084個(gè)，其中包括819個(gè)生物過(guò)程（BP）、87種細(xì)胞組分（CC）和178種分子功能（MF）。各選取排前10名的GO條目繪制柱狀圖（見(jiàn)圖5）。結(jié)果表明，RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、DNA模板轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)的正調(diào)控，藥物應(yīng)答，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等生物過(guò)程均在參仙片防治骨質(zhì)疏松癥過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

圖5 GO功能富集分析結(jié)果Fig.5 Results of GO functional enrichment analysis

2.6 靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析中有121條信號(hào)通路（P＜0.05），取排前20名的條目繪制氣泡圖（見(jiàn)圖6），與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的通路主要有細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、HIF－1信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、PI3K－Akt信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等。

圖6 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.6 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對(duì)接

根據(jù)“藥物－成分－潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的23個(gè)主要活性成分，選擇degree大于均值的前3名的活性成分。與PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊笏玫?9個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的前3個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，分子對(duì)接結(jié)合自由能越小，則表示受體與配體之間的親和力越大（見(jiàn)表1）。將這3個(gè)化合物分別與3個(gè)靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合進(jìn)行可視化處理（見(jiàn)圖7）。結(jié)果顯示，各活性成分與AKT1，IL－6，TP53均有很好的親和力。

圖7 主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接模擬圖Fig.7 Molecular docking simulation of main active ingredients and key targets

表1 活性成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能Tab.1 Binding ability between active ingredients and target proteins

3 討論

正常的骨代謝過(guò)程是骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡。骨吸收由破骨細(xì)胞介導(dǎo)，骨形成則由成骨細(xì)胞介導(dǎo)［5］。當(dāng)骨代謝出現(xiàn)異常，骨吸收超過(guò)骨形成時(shí)，則引起骨質(zhì)疏松癥。遺傳、激素、局部細(xì)胞因子、營(yíng)養(yǎng)攝入、運(yùn)動(dòng)、藥物等因素均會(huì)影響骨代謝過(guò)程［6］。

參仙片中的5味中藥均屬補(bǔ)益類藥物，對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有較好的藥理活性［7－15］。本研究中篩選出參仙片中的關(guān)鍵化學(xué)成分57個(gè)，關(guān)鍵靶點(diǎn)29個(gè)，以及相關(guān)信號(hào)通路121條。其中，排前3名的化學(xué)成分分別為quercetin，moupinamide，citreorosein（quercetin為女貞子和淫羊藿的共有成分［16－17］，moupinamide和citreorosein為何首烏的活性成分［18］），而排前3名的靶點(diǎn)分別為AKT1，IL－6，TP53。已有研究發(fā)現(xiàn)，quercetin不僅可上調(diào)BMP2和Smad4的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化進(jìn)而改善骨質(zhì)疏松癥［19］；還能降低骨內(nèi)SIPS相關(guān)p21，TP53，SASP的水平，使成骨細(xì)胞水平不受影響，進(jìn)而延緩骨細(xì)胞衰老，挽救由雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失［20］。還有研究發(fā)現(xiàn)，quercetin通過(guò)抑制ERK1／2與MAPK mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步抑制ERK1／2－MAPK信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而改善骨小梁結(jié)構(gòu)數(shù)量，增加骨密度［21］。moupinamide能抑制環(huán)氧合酶（COX）1和COX2的活性，發(fā)揮抗炎、抗氧化的藥理作用，保護(hù)成骨細(xì)胞［22］。citreorosein通過(guò)抑制MAPK和AKT介導(dǎo)的IKK磷酸化進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄因子NF－κB活化來(lái)抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［23］。除了“藥物－成分－靶點(diǎn)”的信息，“靶點(diǎn)－信號(hào)通路”在骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制方面也有大量文獻(xiàn)報(bào) 道，如AKT1可 控 制Akt1／forkhead box class O（FoxO）3a／Bim信號(hào)通路，首先使FoxO3a發(fā)生磷酸化，以防止其核定位，從而抑制下游bim基因的激活，最終抑制成骨細(xì)胞的凋亡［24］。IL－6與人體內(nèi)的激素水平有密切關(guān)系，雌激素和雄激素均可通過(guò)激活I(lǐng)L－6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的受體介導(dǎo)作用，抑制成骨細(xì)胞增殖［25］；反之，雌激素缺失引起的骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物的骨髓細(xì)胞中IL－6水平則顯著升高［26］。在骨質(zhì)疏松癥的患者和模型動(dòng)物中，TP53基因表達(dá)和血清p53水平均明顯上調(diào)，說(shuō)明p53水平升高與骨量減少相關(guān)，提示科研人員可通過(guò)抑制p53來(lái)逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥［27］。本研究中不僅采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出參仙片中防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)及分子通路，還對(duì)關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接所展現(xiàn)出的良好親和力和穩(wěn)定構(gòu)象進(jìn)行了驗(yàn)證。

本研究中以參仙片為對(duì)象，對(duì)其中所含活性成分、作用靶點(diǎn)及生物過(guò)程和相關(guān)通路進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)參仙片主要化學(xué)成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)可能通過(guò)多種信號(hào)通路作用于成骨細(xì)胞，刺激成骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)骨細(xì)胞代謝，從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的目的，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑相互作用的結(jié)果。本研究為臨床將參仙片用于骨質(zhì)疏松癥的防治提供了理論基礎(chǔ)，但所收集的疾病和藥物所涉及的靶點(diǎn)可能與目前的熱點(diǎn)研究及報(bào)道的側(cè)重點(diǎn)相關(guān)，導(dǎo)致數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)收集不全面，尚需進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。