血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7在缺血性腦卒中患者中的表達(dá)

田媛媛，耿德勤

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221000)

急性缺血性腦卒中可能引發(fā)永久性腦梗死，占腦卒中患者的70%～80%[1]，發(fā)病早期主要表現(xiàn)為神經(jīng)功能損傷癥狀，嚴(yán)重程度與梗死部位和梗死體積密切相關(guān)[2].靜脈溶栓是目前治療急性缺血性腦卒中最有效的手段，目前，臨床上雖然已對(duì)溶栓禁忌證進(jìn)行了嚴(yán)格篩選，但仍存在一定的出血轉(zhuǎn)化率[3].探討能夠評(píng)估缺血性腦卒中患者病情嚴(yán)重程度和靜脈溶栓后出血轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)的血清分子標(biāo)志物，對(duì)合理制定治療方案、改善患者預(yù)后具有重要意義.S100蛋白參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多個(gè)方面，其功能尚未完全明確[4]；目前研究[5]發(fā)現(xiàn)：S100蛋白表達(dá)水平能夠反映膠質(zhì)細(xì)胞功能，并調(diào)控復(fù)雜神經(jīng)元活性.在大鼠缺血腦組織中可見缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)大量表達(dá)，并調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成、葡萄糖代謝等生物過程[6].腦紅蛋白(NGB)在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中具有保護(hù)作用，能夠降低缺氧對(duì)神經(jīng)元的損傷[7].水通道蛋白7(AQP7)存在于線粒體內(nèi)膜，能夠調(diào)節(jié)腦組織能量平衡，與缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織水腫和神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[8].目前，關(guān)于S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白在缺血性腦卒中患者中表達(dá)特點(diǎn)的研究仍十分少見.為此，本研究主要探討了血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7在缺血性腦卒中患者中的表達(dá)情況.

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2019年2月—2020年4月收治的缺血性腦卒中患者366例，其中，男216例，女150例，年齡52～78歲，平均(62.57±6.05)歲.根據(jù)腦梗死體積分為：小體積梗死組(<5 cm3)198例，中大體積梗死組(≥5 cm3)168例.根據(jù)靜脈溶栓后24 h復(fù)查CT結(jié)果分為出血轉(zhuǎn)化組82例，非出血轉(zhuǎn)化組284例.靜脈溶栓治療前進(jìn)行美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)評(píng)分，根據(jù)評(píng)分結(jié)果，NIHSS評(píng)分≤15分組301例，NIHSS評(píng)分>15分組65例.

入選標(biāo)準(zhǔn)：符合缺血性腦卒中臨床表現(xiàn)，經(jīng)頭顱CT或MRI檢查證實(shí)；首次發(fā)病，起病到入院在4.5 h內(nèi)；入院檢查無靜脈溶栓禁忌證，接受溶栓治療.

排除標(biāo)準(zhǔn)：有顱腦手術(shù)史；合并凝血功能異常、自身免疫性疾病；感染性疾病的患者.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2019-LDH-08).

1.2 方 法

1.2.1 臨床資料

靜脈溶栓治療前進(jìn)行NIHSS評(píng)分，記錄患者的空腹血糖、收縮壓、舒張壓、溶栓時(shí)間窗.梗死體積通過CT或MRI檢查進(jìn)行評(píng)估，計(jì)算公式：梗死體積(mm3)=梗死灶最大長度(mm)×最大垂直直徑(橫向,mm)×梗死層面數(shù)×5(mm)/2.

1.2.2 Western blot檢測S100B、HIF-1α、NGB、AQP7的表達(dá)水平

靜脈溶栓治療前采集患者外周靜脈血4 mL，使用蛋白提取試劑盒(北京金克隆生物科技有限公司)提取血清總蛋白，BCA試劑盒(北京鼎國昌盛生物有限公司)測定蛋白濃度，-80 ℃保存待測.取其中50 g蛋白樣本，行濃度6%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)模60 min.室溫下使用濃度10%的脫脂奶粉封閉2 h，滴加鼠抗人S100B單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(1∶300稀釋)、兔抗人NGB單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人AQP7單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，次日滴加對(duì)應(yīng)的二抗：羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG(1∶3 000稀釋)，室溫下靜置2 h，洗膜、顯色、曝片后進(jìn)行分析.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同梗死體積組患者臨床資料

中大體積梗死組患者NIHSS評(píng)分、收縮壓、舒張壓明顯高于小體積梗死組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空腹血糖、溶栓時(shí)間窗在小體積梗死組與中大體積梗死組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見表1.

2.2 不同出血轉(zhuǎn)化情況組患者臨床資料

出血轉(zhuǎn)化組患者NIHSS評(píng)分、空腹血糖、收縮壓、舒張壓、溶栓時(shí)間窗明顯高于非出血轉(zhuǎn)化組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表2.

表1 不同梗死體積組患者臨床資料Tab.1 Clinical data of patients with different infarct volumes

表2 不同出血轉(zhuǎn)化組患者臨床資料Tab.2 Clinical data of patients with different infarct volumes

組別nNIHSS評(píng)分/分c(空腹血糖)/(mmol·L-1)p(收縮壓)/mmHgp (舒張壓)/mmHgt(溶栓時(shí)間窗)/min非出血轉(zhuǎn)化組2848.19±1.575.76±0.91144.50±15.8285.34±11.67263.28±31.75出血轉(zhuǎn)化組8212.64±1.656.83±1.18182.39±18.14113.08±14.45320.49±59.56t9.5375.20922.45117.28526.917P0.0150.038<0.001<0.001<0.001

2.3 不同梗死體積組患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白的表達(dá)水平

中大體積梗死組患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表達(dá)水平明顯高于小體積梗死組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表3，圖1.

2.4 不同出血轉(zhuǎn)化情況組患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白的表達(dá)水平

出血轉(zhuǎn)化組患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表達(dá)水平明顯高于非出血轉(zhuǎn)化組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表4，圖2.

表3 不同梗死體積組患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白的表達(dá)水平Tab.3 Serum S100B，HIF-1α，NGB and AQP7 protein expression levels in patients with different infarct volumes

表4 不同出血轉(zhuǎn)化情況組患者S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白的表達(dá)水平Tab.4 S100B，HIF-1α，NGB and AQP7 protein expression levels in patients with different hemorrhagic transformation groups

1、2.小體積梗死組;3、4.中大體積梗死組.圖1不同梗死體積患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表達(dá)Fig.1Protein expression of serum S100B,HIF-1α,NGB and AQP7 of patients with different infarct volumes1、2.非出血轉(zhuǎn)化組;3、4.出血轉(zhuǎn)化組.圖2不同出血轉(zhuǎn)化患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表達(dá)Fig.2Protein expression of serum S100B,HIF-1α,NGB and AQP7 transformation of patients with different hemorrhagic transformation

2.5 不同NIHSS評(píng)分組患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白的表達(dá)水平

NIHSS評(píng)分>15分組患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表達(dá)水平明顯高于NIHSS評(píng)分≤15分組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表5，圖3.

表5 不同NIHSS評(píng)分組患者S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白的表達(dá)水平Tab.5 S100B，HIF-1α，NGB and AQP7 protein expression levels in different NIHSS score groups

1、2.NIHSS評(píng)分≤15分組；3、4.NIHSS評(píng)分>15分組.圖3 不同評(píng)分組患者血清S100B、HIF-1α、 NGB、AQP7蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expression of serum S100B，HIF-1α，NGB and AQP7 of patients with different scores

3 討 論

早期溶栓治療是目前改善缺血性腦卒中患者預(yù)后的最有效手段，但受腦缺血再灌注損傷的影響，存在一定比例的溶栓后出血轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致羥自由基大量生成引發(fā)神經(jīng)毒性，改變血腦屏障的通透性，出現(xiàn)腦水腫，增加缺血半暗帶體積[9].本研究結(jié)果顯示：中大體積梗死組患者NIHSS評(píng)分、收縮壓、舒張壓明顯高于小體積梗死組；出血轉(zhuǎn)化組患者NIHSS評(píng)分、空腹血糖、收縮壓、舒張壓、溶栓時(shí)間窗明顯高于非出血轉(zhuǎn)化組.提示NIHSS評(píng)分、收縮壓及舒張壓升高與梗死體積和溶栓后出血轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，同時(shí)空腹血糖和溶栓時(shí)間窗增加也會(huì)提高溶栓后出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn).

S100B蛋白主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中.本研究結(jié)果顯示：中大體積梗死組患者血清S100B蛋白水平明顯高于小體積梗死組，可能原因：隨著梗死體積的增加，腦膠質(zhì)細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙，并且發(fā)生持續(xù)性凋亡，最終導(dǎo)致S100B蛋白外溢[10].因此，監(jiān)測血清S100B蛋白水平變化有助于評(píng)估缺血性腦卒中患者梗死體積的變化情況；出血轉(zhuǎn)化組患者血清S100B蛋白水平明顯高于非出血轉(zhuǎn)化組.S100B蛋白分子量較大，正常生理狀態(tài)下無法通過血腦屏障，腦組織損傷時(shí)血腦屏障和腦細(xì)胞被破壞，S100B蛋白釋放入血，血清S100B蛋白水平越高反映缺血性腦卒中患者出血轉(zhuǎn)化程度越嚴(yán)重[11].HIF-1α是存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的氧調(diào)節(jié)亞基，缺氧狀態(tài)下水解HIF-1α的酶活性減弱，其在體內(nèi)累積，啟動(dòng)機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)[12].目前對(duì)于HIF-1α的研究主要集中在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，其在臨床中的應(yīng)用價(jià)值研究仍十分少見.本研究結(jié)果顯示：隨著梗死體積的增加，血清HIF-1α水平明顯升高，且在出血轉(zhuǎn)化組患者血清中的表達(dá)水平明顯高于非出血轉(zhuǎn)化組，可能原因：缺血性腦卒中梗死體積和出血嚴(yán)重程度與腦組織缺氧程度呈正相關(guān)，監(jiān)測血清HIF-1α水平變化有利于對(duì)缺血性腦卒中患者的病情進(jìn)行評(píng)估和溶栓方案的選擇.

NGB是具有神經(jīng)保護(hù)活性的蛋白，既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)[13-14]均發(fā)現(xiàn)，急性缺血、缺氧狀態(tài)下NGB水平明顯升高，可能其在缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用.在上述研究基礎(chǔ)上，本研究對(duì)NGB在缺血性腦卒中患者中表達(dá)變化進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：隨著梗死體積的增加，患者血清NGB水平明顯升高，且在出血轉(zhuǎn)化組患者血清中的表達(dá)水平明顯高于非出血轉(zhuǎn)化組，說明NGB能夠較好地評(píng)價(jià)缺血性腦卒中患者的梗死體積，預(yù)測溶栓治療的預(yù)后情況.AQP家族廣泛存在于人體多個(gè)臟器的細(xì)胞膜上，AQP9表達(dá)與腦水腫的關(guān)系已被研究證實(shí)[15]，但AQP7與腦組織病理改變的關(guān)系的研究仍十分少見.相關(guān)研究[16]顯示：AQP7與電解質(zhì)紊亂密切相關(guān).本研究結(jié)果顯示：AQP7水平隨著梗死體積的增加和溶栓后出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生明顯提高，提示血清AQP7水平變化可用于評(píng)估缺血性腦卒中患者的病情嚴(yán)重程度和溶栓治療出血轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn).有研究[17]報(bào)道，燈盞乙素能夠明顯下調(diào)缺血性腦損傷大鼠腦組織模型的HIF-1α、AQP7表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，降低大鼠腦水腫的發(fā)生率，因此，HIF-1α、AQP7在缺血性腦卒中患者中的協(xié)調(diào)作用有待于深入研究.目前，臨床用于判斷缺血性腦卒中患者病情嚴(yán)重程度的公認(rèn)指標(biāo)為NIHSS評(píng)分，為進(jìn)一步提高研究結(jié)論的可靠性，本研究將缺血性腦卒中患者按照溶栓前的NIHSS評(píng)分分為NIHSS評(píng)分≤15分組(輕中度缺血性腦卒中)、NIHSS評(píng)分>15分組(重度缺血性腦卒中).本研究結(jié)果顯示：NIHSS評(píng)分>15分組患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表達(dá)水平明顯高于NIHSS評(píng)分≤15分組，提示血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表達(dá)水平與缺血性腦卒中患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可用于臨床對(duì)患者病情的評(píng)估.

綜上所述，血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7在缺血性腦卒中患者中高表達(dá)，且與梗死體積、溶栓后出血轉(zhuǎn)化發(fā)生率以及NIHSS評(píng)分明顯相關(guān)，可用于缺血性腦卒中患者病情嚴(yán)重程度的動(dòng)態(tài)監(jiān)測和溶栓后出血風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估.