胰島素樣生長(zhǎng)因子-2對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)橫斷性損傷后再生修復(fù)的影響

郭天明，熊 靖 ,郭建平 ,李增新，劉權(quán)祥，齊明宇，白長(zhǎng)雙，代起志，李 卓

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132011； 3.吉林市人民醫(yī)院，吉林 吉林 132001；4.吉林市龍?zhí)秴^(qū)人民醫(yī)院，吉林 吉林 132021)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展至今，外科技術(shù)不斷取得進(jìn)展，但周圍神經(jīng)損傷后的重建以及功能恢復(fù)仍然是臨床實(shí)踐中的一個(gè)挑戰(zhàn)[1-2].周圍神經(jīng)離斷后修復(fù)與再生需要經(jīng)歷一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，往往在修復(fù)前，神經(jīng)殘端會(huì)萎縮或膨大，在修復(fù)過(guò)程中的瘢痕形成為后續(xù)治療及康復(fù)帶來(lái)了極大困難，因此，在周圍神經(jīng)離斷損傷的治療上，積極促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)與再生極其重要[3].有研究[4]報(bào)道，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)對(duì)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)及再生具有促進(jìn)作用.胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(insulin-like growth factor-2，IGF-2)是結(jié)構(gòu)與IGF-1相似的多肽，與IGF-1同屬于胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)，是目前為止功能最復(fù)雜的生長(zhǎng)調(diào)控因子，它不僅在細(xì)胞的增殖分化、生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程中起重要作用，同時(shí)IGF-2 可調(diào)控神經(jīng)元和突觸重塑，在維持記憶的保存功能中發(fā)揮重要作用[5].目前，IGF-2對(duì)周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)過(guò)程的研究尚無(wú)報(bào)道.本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)橫斷損傷模型，探討IGF-2在大鼠坐骨神經(jīng)損傷愈合過(guò)程中的作用.

1 材 料

1.1 動(dòng) 物

選取40只Wis-tar雄性成年大鼠(長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SSCK(吉)2019-0021)，體質(zhì)量210～280 g，清潔級(jí)，動(dòng)物在光暗條件、溫度、濕度相同的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食.本研究過(guò)程符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》中的要求.

1.2 試劑、儀器

IGF-2蛋白干粉(珠海億勝生物制藥有限公司)，用生理鹽水配制成所需濃度；七氟醚(四川國(guó)瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司)；萬(wàn)古霉素(政德制藥有限公司)；組織包埋機(jī)(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；石蠟切片機(jī)(上海華靈康復(fù)器材廠)；組織脫水機(jī)(天津市久圣醫(yī)療電子儀器有限公司)；推片烤片機(jī)(珠海億勝生物制藥有限公司)；9-0尼龍縫線、3-0 號(hào)線(江西龍騰生物高科技有限公司)；顯微手術(shù)器械(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；光學(xué)顯微鏡(上海聯(lián)輝醫(yī)療用品有限公司).

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將大鼠隨機(jī)分為IGF-2組、地塞米松組、生理鹽水組、 空白組，每組各10只.所有大鼠全部行坐骨神經(jīng)離斷術(shù)，術(shù)后6 h縫合神經(jīng)斷端，于縫合端神經(jīng)外膜分別應(yīng)用IGF-2、地塞米松、生理鹽水及空白處理，最后縫合肌肉、筋膜、皮膚，常規(guī)消毒.縫合切口過(guò)程中，逐層外用萬(wàn)古霉素抗感染處理.術(shù)后2、4、6、8、12周分別采用足印實(shí)驗(yàn)檢測(cè)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic fuctionalindex，SFI).于術(shù)后第12周沿原切口解剖，截取坐骨神經(jīng)斷端縫合處2 cm長(zhǎng)的坐骨神經(jīng)，剝離小鼠雙下肢腓腸肌進(jìn)行肌肉濕質(zhì)量比檢測(cè)，取出右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷處樣本后，按手術(shù)前的分組，截取部分神經(jīng)保存在甲醛中，行HE染色.

2.2 大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型制備

40只Wis-tar雄性成年大鼠全部接受坐骨神經(jīng)離斷手術(shù)，坐骨神經(jīng)的離段與縫合操作在顯微鏡下進(jìn)行.手術(shù)過(guò)程[6]：七氟醚采用吸入麻醉處理，取小鼠左側(cè)臥位.右側(cè)大腿外側(cè)備皮，切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干，于梨狀肌下緣1 cm處整齊切斷坐骨神經(jīng)干，6 h后用9-0縫合線進(jìn)行神經(jīng)外膜縫合，使之成為坐骨神經(jīng)損傷模型.

2.3 SFI測(cè)定

自制長(zhǎng)50 cm、寬8.5 cm、高10 cm的長(zhǎng)方體盒子作為足印測(cè)試裝置，盒子底層鋪放一張白紙，大鼠模型兩后足蘸適量的碳素墨水后放入盒中，驅(qū)使模型大鼠從箱體一側(cè)走向另一側(cè)，在白紙上采集有效足印，待足印干燥后，選取白紙清晰的足印測(cè)量PL(足印長(zhǎng)，后足跟至前足趾間距離)、TS(足印寬，第1個(gè)足趾至第5個(gè)足趾間的距離)、IT(足中間三趾寬，第2個(gè)足趾至第4個(gè)足趾間的距離)，并根據(jù)Bain公式：SFI=-38.3(E-PL-N-PL)/N-PL+109.5(E-TS-N-TS)/TS+13.3(E-IT-N-IT)/N-IT-8.8，計(jì)算SFI指數(shù)[7](N為正常側(cè)，E為手術(shù)側(cè)).

2.4 肌肉濕質(zhì)量比檢測(cè)

取材及肌肉濕質(zhì)量比[8]檢測(cè)：術(shù)后12周各組大鼠進(jìn)行麻醉，處死并取各組大鼠兩側(cè)后肢腓腸肌.取材時(shí)大體觀察雙側(cè)腓腸肌飽滿度和萎縮度.觀察后并用普通吸水紙吸去殘留在肌肉表面的血液，用電子天平分別稱取各組肌肉濕質(zhì)量.以各自非手術(shù)側(cè)作為對(duì)照，計(jì)算各組大鼠的腓腸肌濕質(zhì)量比.肌濕質(zhì)量比=E側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量/N側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量.

2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察

在上述各組大鼠坐骨神經(jīng)縫合處切取神經(jīng)標(biāo)本2 cm，行石蠟包埋切片、蘇木素染色、酸酒精分色、氨酒精返藍(lán)、伊紅復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察神經(jīng)軸突排列分布及髓鞘的改變.

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 一般情況

術(shù)后4組40只Wistar雄性成年大鼠均完全存活，進(jìn)食正常，術(shù)后第2天均出現(xiàn)了不同程度足下垂、跛行、足部皮膚紅腫等現(xiàn)象.術(shù)后2周，4組大鼠切口皮膚愈合良好，縫合線逐漸脫落.各組大鼠展抓反射消失，術(shù)后8周，IGF-2組、地塞米松組展抓功能有所恢復(fù)，分趾功能出現(xiàn).

3.2 IGF-2對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠SFI的影響

各組大鼠SFI值及其隨時(shí)間變化情況見表1、圖1.術(shù)后2～12周，各個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)IGF-2組模型大鼠SFI值明顯高于空白組及生理鹽水組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后2、4、6周，3個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)IGF-2組模型大鼠SFI值低于地塞米松組(P<0.05)，8、12周，兩個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)IGF-2組模型大鼠SFI值與地塞米松組模型大鼠SFI值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).其中8周與12周兩個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)空白組、生理鹽水組模型大鼠SFI值組內(nèi)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).IGF-2組及地塞米松組于8周與12周兩個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)SFI值組內(nèi)之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

圖1 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠SFI值Fig.1 SFI in rats after operation

表1 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠SFI值Tab.1 SFI in rats at different postoperative times

3.3 IGF-2對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型患肢肌肉質(zhì)量的影響

模型組大鼠手術(shù)側(cè)腓腸肌與非手術(shù)組比較，飽滿度明顯降低，彈性減弱，色澤欠佳，呈肌萎縮狀態(tài).IGF-2組較空白組與生理鹽水組肌濕質(zhì)量比明顯增高(P<0.05)，IGF-2組較地塞米松組肌濕質(zhì)量比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見表2.

表2 術(shù)后12周各組大鼠手術(shù)側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量比Tab.2 Wet mass ratio of postoperative lateral

3.4 組織形態(tài)學(xué)改變

空白組及生理鹽水組大鼠坐骨神經(jīng)損傷處神經(jīng)纖維排列紊亂，粗細(xì)不均，髓鞘不完整，成纖維細(xì)胞較多.地塞米松組及IGF-2組大鼠坐骨神經(jīng)損傷處神經(jīng)纖維排列較為整齊，粗細(xì)均勻，髓鞘較為完整，神經(jīng)組織內(nèi)成纖維細(xì)胞少，其中IGF-2組大鼠坐骨神經(jīng)損傷處可見少量脂肪組織.

4 討 論

周圍神經(jīng)損傷的類型較多，最為嚴(yán)重的就是神經(jīng)橫斷性損傷，神經(jīng)橫斷性損傷可導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)膜破裂，神經(jīng)內(nèi)瘢痕增生嚴(yán)重，嚴(yán)重阻礙軸突的再生，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能恢復(fù)困難，因此，提高周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)能力極其重要[9].

大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型較多，其中以坐骨神經(jīng)鉗夾模型和坐骨神經(jīng)離斷模型最為多見，本實(shí)驗(yàn)建模采用坐骨神經(jīng)離斷模型建模方法[10]，因?yàn)樽巧窠?jīng)離斷模型神經(jīng)損傷更為嚴(yán)重，損傷程度更容易把握，對(duì)比神經(jīng)功能恢復(fù)情況更為直觀.

SFI是較為可靠的評(píng)價(jià)坐骨神經(jīng)損傷后患肢功能恢復(fù)情況的指標(biāo).本研究通過(guò)采用足印法計(jì)算各組各時(shí)間點(diǎn)SIF值，比較后發(fā)現(xiàn)IGF-2組較空白組及生理鹽水組SFI值明顯增高，這說(shuō)明IGF-2對(duì)于坐骨神經(jīng)橫斷性損傷后的神經(jīng)再生及功能恢復(fù)具有一定作用.本研究結(jié)果顯示：IGF-2組和地塞米松組在8周以前SIF值均呈上升趨勢(shì)，且地塞米松組SFI值明顯高于IGF-2組(P<0.05)，而8周以后兩組SFI值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).這說(shuō)明IGF-2治療周圍神經(jīng)橫斷性損傷早期(8周以前)效果不如地塞米松，但兩種藥物治療神經(jīng)橫斷性損傷的功能恢復(fù)遠(yuǎn)期效果基本相同，且IGF-2治療效果更平穩(wěn)，作用更持久，這可能與IGF-2具有促進(jìn)新生血管形成、防止神經(jīng)瘢痕產(chǎn)生以及促進(jìn)蛋白表達(dá)的功能有關(guān)[11].

地塞米松有抑制成纖維細(xì)胞增生、減少神經(jīng)瘢痕的形成、防止神經(jīng)與周圍肌肉組織黏連的作用，但地塞米松可抑制蛋白生成，其對(duì)于促進(jìn)神經(jīng)再生與修復(fù)的時(shí)間較IGF-2短[12-13].而IGF-2通過(guò)促進(jìn)蛋白合成、刺激肌成纖維細(xì)胞的增殖和分化而達(dá)到生肌作用，為周圍神經(jīng)再生及功能恢復(fù)提供有利的外周環(huán)境[14-15]，可促進(jìn)脂肪和新血管生成，從而在保護(hù)周圍神經(jīng)的同時(shí)，又為周圍神經(jīng)提供營(yíng)養(yǎng)[16]，這是IGF-2促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)作用較地塞米松更平穩(wěn)、持久的原因.

綜上所述，IGF-2對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用，且其還能促進(jìn)患肢肌肉增生，有效促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生.