榿葉唐棣果酒發(fā)酵工藝及有機(jī)酸和揮發(fā)性成分分析

于 杰，韓 菁，張卓睿，姜貴全

(北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013)

榿葉唐棣(AmelanchieralnifoliaNutt.)為薔薇科(Rosaceae)唐棣屬落葉灌木或小喬木，果實(shí)形似藍(lán)莓[1].榿葉唐棣果實(shí)中富含果膠，可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收[2]，還含有多酚類化合物，能夠調(diào)節(jié)血糖血脂、保護(hù)血管、預(yù)防腫瘤[3-4].榿葉唐棣中黃酮類化合物可通過細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成來抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)[5]；果肉和果皮中含有花色苷，可以降血脂、降血糖、保護(hù)心臟、預(yù)防心腦血管疾病[6-7].

果酒是以果實(shí)為原料，經(jīng)破碎、成分調(diào)整、酒精發(fā)酵釀制而成的低度酒[8].有機(jī)酸是影響果酒風(fēng)味和品質(zhì)的重要成分之一，適量的有機(jī)酸能夠改善果酒風(fēng)味[9]，促進(jìn)多糖轉(zhuǎn)化以及果膠物質(zhì)分解[10-11].果酒的香氣和口感決定產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)結(jié)果，是衡量果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[12-13].本試驗(yàn)以酒精度為檢測(cè)指標(biāo)，優(yōu)化榿葉唐棣果酒發(fā)酵工藝，分析其中的有機(jī)酸及揮發(fā)性成分，為榿葉唐棣果酒開發(fā)和生產(chǎn)提供理論依據(jù).

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

榿葉唐棣，2019年5月采自北華大學(xué)磨盤山實(shí)習(xí)基地；果酒酵母，湖北安琪酵母股份有限公司；帝伯仕果酒酵母，煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(草酸、蘋果酸、丙二酸、乳酸、乙酸)，上海精純?cè)噭┯邢薰?；磷酸二氫銨、磷酸，均為分析純；甲醇(色譜純)，天津致遠(yuǎn)股份有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；SPX-2500S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LC-15C高效液相色譜儀，日本島津公司；Agilent 5977C-7890B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫儀器設(shè)備有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 榿葉唐棣果酒發(fā)酵工藝

1)工藝流程：榿葉唐棣原果→挑選除雜→清洗→破碎→成分調(diào)整→酵母菌活化→接種酵母菌→酒精發(fā)酵→過濾→成品.

2)操作要點(diǎn)：手工破碎榿葉唐棣果實(shí)，避免打漿導(dǎo)致破碎過度；調(diào)整成分時(shí)要混合均勻，以免影響發(fā)酵；酒精發(fā)酵時(shí)裝到罐體積的2/3左右，避免發(fā)酵過程中產(chǎn)氣過多，漲破罐體.

3)菌種篩選：以酒精度(酒精體積分?jǐn)?shù))作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察安琪果酒專用酵母(RW)、安琪果酒專用酵母(SY)和帝伯仕果酒酵母3種酵母的產(chǎn)酒量.

4)發(fā)酵條件：以酒精度為評(píng)定指標(biāo)，分別考察酵母添加量(0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)、加糖量(16%、18%、20%、22%、24%)、發(fā)酵溫度(16、18、20、25、28 ℃)對(duì)酒精發(fā)酵的影響.

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9(33) 正交試驗(yàn)，以酵母添加量(A)、加糖量(B)、發(fā)酵溫度(C)為3個(gè)因素，以酒精度為考察指標(biāo)，優(yōu)化榿葉唐棣果酒發(fā)酵工藝條件.正交試驗(yàn)因素水平見表1.

表1 酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factor level of orthogonal test for alcohol fermentation

1.3.2 分析檢測(cè)方法

1)酒精度測(cè)定.酒精度測(cè)定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法中》的酒精計(jì)法[14].

2)有機(jī)酸含量測(cè)定.

樣品預(yù)處理.原果汁和優(yōu)化發(fā)酵條件后的榿葉唐棣果酒過200目紗布，取5.00 mL待測(cè)樣品，加入2.00 g聚酰胺后于70 ℃水浴鍋中加熱5 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液加入2.00 mL 1 mol/L磷酸溶液和5.00 mL蒸餾水，過0.45 μm濾膜，備用.

色譜條件.參考GB 5009.157—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中有機(jī)酸的測(cè)定》中果汁飲料及果汁、果味碳酸飲料的有機(jī)酸測(cè)定方法[15].

3)揮發(fā)性成分測(cè)定.

樣品預(yù)處理.參考彭幫柱等[16]的樣品處理方法.

氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)機(jī)工作條件.色譜柱：HP-5ms(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：He(純度>99.999%)；流速：1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣.

程序升溫.起始溫度為40 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升溫至85 ℃，保持2min；以5 ℃/min升溫至110 ℃，保持2 min；以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持8 min.

MS條件.電子電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍為35～400 m/z.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016錄入、計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Origin 8.0軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 榿葉唐棣果酒發(fā)酵條件

2.1.1 酵母種類

不同果酒酵母發(fā)酵榿葉唐棣果酒的酒精度見圖1.由圖1可知：在相同發(fā)酵條件下，不同果酒酵母榿葉唐棣果酒產(chǎn)酒量有所區(qū)別.其中，安琪果酒專用酵母(RW)酒精度為7.2%，安琪果酒專用酵母(SY)酒精度為7.8%，帝伯仕果酒酵母酒精度為5.6%，確定安琪果酒專用酵母(SY)為本次試驗(yàn)所用果酒酵母.

2.1.2 酵母添加量

酵母添加量對(duì)酒精度的影響見圖2.由圖2可知：隨著酵母添加量的增加，產(chǎn)酒量增加.酵母添加量過少，產(chǎn)酒量少；酵母添加量過多，酵母菌在發(fā)酵初期快速繁殖，產(chǎn)酒量迅速上升，但發(fā)酵后期酒精度過高，抑制了酵母菌生長(zhǎng).酵母添加量為0.04%、0.06%、0.08%時(shí)，發(fā)酵后期產(chǎn)酒量相近，第11天產(chǎn)酒量達(dá)到峰值，酒精度分別為13.5%、14.0%、13.8%.考慮經(jīng)濟(jì)成本和產(chǎn)酒量，確定0.06%為最優(yōu)酵母添加量.

圖1不同果酒酵母發(fā)酵榿葉唐棣果酒的酒精度Fig.1Alcohol production of fruit wine fermentation forAmelanchier alnifolia圖2酵母添加量對(duì)酒精度的影響Fig.2Effect of yeast addition on alcohol content

2.1.3 加糖量

加糖量對(duì)酒精度的影響見圖3.由圖3可知：隨著加糖量的增加，產(chǎn)酒量也隨之增加.加糖量過少，產(chǎn)酒量少；加糖量過多，滲透壓升高，影響酵母菌的繁殖和代謝，產(chǎn)酒量相對(duì)較低.加糖量為18%、20%、22%時(shí)，發(fā)酵后期產(chǎn)酒量相近，第11天產(chǎn)酒量達(dá)到峰值，酒精度分別為14.5%、14.7%、15.4%.因此，確定22%為最優(yōu)加糖量.

2.1.4 發(fā)酵溫度

以不同溫度進(jìn)行酒精發(fā)酵，結(jié)果見圖4.由圖4可知：隨著溫度升高，產(chǎn)酒量增加.溫度過低，產(chǎn)酒量相對(duì)較少；溫度過高，酵母菌老化速度加快，發(fā)酵后期產(chǎn)酒量相對(duì)較低.溫度為20、22、25 ℃時(shí)，發(fā)酵后期產(chǎn)酒量相近，第11天酒精度分別為14.3%、15.0%、15.2%.因此，確定22 ℃為最優(yōu)發(fā)酵溫度.

圖3加糖量對(duì)酒精度的影響Fig.3Effect of sugar content on alcohol content圖4發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響Fig.4Effect of fermentation temperature on alcohol content

2.2 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

在酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行3因素3水平L9(33)正交試驗(yàn)，以酒精度為考察指標(biāo).酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3.由表2、3可知：在榿葉唐棣果酒酒精發(fā)酵過程中，加糖量和發(fā)酵溫度是主要的影響因素，其中，加糖量是顯著因素(P<0.05)，發(fā)酵溫度是極顯著因素(P<0.01)，酵母添加量對(duì)榿葉唐棣果酒酒精發(fā)酵的影響不顯著(P>0.1).由表4可知：優(yōu)化后的最佳工藝組合為A2B3C3，即酵母添加量0.06%，加糖量22%，發(fā)酵溫度25 ℃，結(jié)合單因素試驗(yàn)，將第9天確定為酒精發(fā)酵終止時(shí)間，在此條件下的最終酒精度為15.7%.

表2 酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results for alcohol fermentation

表3 酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.3 Variance analysis results of orthogonal test for alcohol fermentation

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of verification test

2.3 有機(jī)酸組成

采用反相高效液相色譜法對(duì)榿葉唐棣原果汁和果酒中的有機(jī)酸進(jìn)行定性和定量分析.樣品有機(jī)酸色譜見圖5，有機(jī)酸含量見表5.由圖5可知：榿葉唐棣原果汁中的有機(jī)酸為蘋果酸、草酸、丙二酸、乙酸；果酒中的有機(jī)酸為蘋果酸、乳酸、丙二酸、草酸、乙酸.由表5可知：榿葉唐棣果汁中蘋果酸質(zhì)量濃度最高，為1.20 mg/mL；草酸、丙二酸次之，均為0.47 mg/mL；草酸和乙酸質(zhì)量濃度相對(duì)較低，這些有機(jī)酸構(gòu)成了榿葉唐棣漿果獨(dú)特的口感.與榿葉唐棣果汁相比，榿葉唐棣果酒中蘋果酸含量明顯低于榿葉唐棣果汁.由于酒精發(fā)酵過程中部分蘋果酸被轉(zhuǎn)化成酒精和乳酸，因此蘋果酸含量下降[17-18]，并且在果酒中檢出乳酸，質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL，丙二酸和蘋果酸質(zhì)量濃度最高，均為0.56 mg/mL，草酸(0.12 mg/mL)相對(duì)較低.

圖5 反相高效液相色譜Fig.5 Reversed-phase high performance liquid chromatogram

表5 榿葉唐棣果汁和果酒有機(jī)酸含量分析結(jié)果Tab.5 Analysis results of organic acid content in Amelanchier alnifolia juice and fruit wineρ/(mg·mL-1)

2.4 揮發(fā)性成分

使用靜態(tài)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析榿葉唐棣果汁和果醋揮發(fā)性成分，通過MS分析、對(duì)照NIST14.L質(zhì)譜譜庫鑒定得到的組分，結(jié)果見表6.由表6可知：由榿葉唐棣果汁中分離出5種化合物，其中，苯甲醛(73.53%)相對(duì)含量最高，為榿葉唐棣果汁主要揮發(fā)性成分，具有苦杏仁味；由榿葉唐棣果酒中分離出10種化合物，其中，乙醇(34.68%)是榿葉唐棣果酒主要揮發(fā)性組分，具有刺激性辛辣味，丁二酸二乙酯(20.73%)相對(duì)含量次之，具有令人愉快的水果味[19].

表6 揮發(fā)性成分分析結(jié)果Tab.6 Analysis results of volatile components

3 結(jié) 論

榿葉唐棣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值相對(duì)較高，可用來發(fā)酵果酒.本研究顯示：榿葉唐棣最佳發(fā)酵工藝條件為安琪果酒專用酵母(SY)酵母添加量0.06%，加糖量22%，30 ℃發(fā)酵9 d.

通過反相高效液相色譜法從榿葉唐棣果汁中檢測(cè)出4種有機(jī)酸，其中，蘋果酸(1.20 mg/mL)質(zhì)量濃度最高，丙二酸(0.47 mg/mL)次之；榿葉唐棣果酒中檢測(cè)出5種有機(jī)酸，其中，丙二酸(0.56 mg/mL)、蘋果酸(0.56 mg/mL)質(zhì)量濃度相對(duì)較高.

通過靜態(tài)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)榿葉唐棣果汁和果酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，從榿葉唐棣果汁中分離出5種化合物，其中，苯甲醛(73.53%)相對(duì)含量最高，其次為乙酸-3-甲基丁酯(20.76%)；從榿葉唐棣果酒中分離出10種化合物，其中，乙醇(34.68%)和丁二酸二乙酯(20.73%)相對(duì)含量較高.由此確定，果酒中主要揮發(fā)性成分為醇類和酯類.

試驗(yàn)優(yōu)化的工藝參數(shù)可為榿葉唐棣果酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，有機(jī)酸和揮發(fā)性成分檢測(cè)和鑒定結(jié)果可為產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù).