河源地區(qū)新生兒聽(tīng)力與基因聯(lián)合篩查模式應(yīng)用分析

劉運(yùn)華，吳坤，劉曉燕，李婷婷，王葭，李登峰

（1.廣東省河源市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室；2.廣東省河源市婦幼保健院兒童保健科，廣東 河源 517000）

先天性聽(tīng)力損失作為全球最常見(jiàn)的感覺(jué)功能障礙性疾病，除表現(xiàn)患兒聽(tīng)力功能下降外，還可對(duì)患兒智力、語(yǔ)言的發(fā)育造成不良后果[1]。幼兒期的聽(tīng)力下降會(huì)導(dǎo)致言語(yǔ)障礙、學(xué)習(xí)表現(xiàn)差和增加輟學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)，影響未來(lái)就業(yè)等問(wèn)題[2]。研究發(fā)現(xiàn)2015年全球聽(tīng)力損失率大大高于2013年之前公布的估計(jì)值[3]。因此提高聽(tīng)力損失防范意識(shí)、重視耳聾的出生缺陷防控工作顯得尤為重要。

傳統(tǒng)技術(shù)，耳聲發(fā)射法（otoacoustic emission，OAE）不能用于檢測(cè)聽(tīng)神經(jīng)性功能障礙，其結(jié)果存在一定假陰性，而自動(dòng)判別聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位法（auto auditory brainstem response，AABR）費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，成本高，最關(guān)鍵是其不能發(fā)現(xiàn)遲發(fā)型、漸進(jìn)性及藥物敏感性的聽(tīng)力損失。研究發(fā)現(xiàn)先天性聽(tīng)力損失的兒童，80%是由遺傳原因?qū)е?。遺傳性耳聾根據(jù)有無(wú)外耳及其它器官畸形等臨床癥狀分為綜合征型耳聾（約30%）和非綜合征型耳聾（約70%）。非綜合征型遺傳性聽(tīng)力損失具有遺傳異質(zhì)性的特點(diǎn)，東亞人群遺傳性耳聾基因以GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA及GJB3 突變?yōu)橹?。迄今為止，已?10多個(gè)基因中鑒定出6000多個(gè)致病變異，其中確定了超過(guò)40 個(gè)致病基因[4]。由此可見(jiàn)，新生兒聽(tīng)力篩查聯(lián)合遺傳性耳聾易感基因篩查，將能大大減少聽(tīng)力損失患兒的發(fā)生。

河源地區(qū)是客家人主要聚集地之一，有種族和地域特色。河源戶籍新生兒遺傳性耳聾基因分布特點(diǎn)尚未知。本研究旨在通過(guò)分析6738例河源戶籍新生兒聽(tīng)力篩查和4 個(gè)遺傳性耳聾基因13個(gè)致病變異攜帶情況，探討新生兒聽(tīng)力檢查與遺傳性耳聾易感基因聯(lián)合篩查模式效果及其應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選2018年12 月-2020年12 月在我院出生并進(jìn)行聽(tīng)力篩查及耳聾基因檢測(cè)的新生兒6738例，出生時(shí)Apgar 評(píng)分均為10 分，所有新生兒均為母嬰同室,均無(wú)產(chǎn)科并發(fā)癥；其中男嬰3620例，女嬰3118例。男嬰母親孕齡29.08±4.75（歲）、女嬰母親孕齡28.75±4.59（歲），男嬰出生體重3166.11±441.69（g）、女嬰出生體重3077.88±444.77（g），男嬰身長(zhǎng)49.99±7.65（cm）、女嬰身長(zhǎng)49.61±1.64（cm），男嬰分娩孕周38.89±1.65 (周)，女嬰分娩孕周39.10±1.49 (周)。父母均為河源籍貫，聯(lián)合篩查前均進(jìn)行充分的知情同意。

1.2 材料 DNA 自動(dòng)提取儀Lab-Aid 824及配套試劑（致善生物有限公司）、耳聾易感基因檢測(cè)試劑（潮州凱普生物化學(xué)有限公司）、VertiTMDx 96 Well Thermal Cycler RCR 擴(kuò)增儀(賽默飛)、丹麥AccuScreen 新生兒聽(tīng)力篩查器（上海涵榮醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 聽(tīng)力篩查方法 2010年衛(wèi)生部頒發(fā)《聽(tīng)力篩查技術(shù)規(guī)范（衛(wèi)婦社發(fā)〔2010〕96 號(hào)）》，要求新生兒出生后48h 至出院前完成初篩第一階段（OAE/AABR），未通過(guò)者及遺漏者于42d 內(nèi)進(jìn)行初篩第二階段（OAE+AABR）。

1.4 耳聾基因篩查方法 采新生兒EDTA 抗凝臍帶血2ml，提取基因組DNA，本研究采用PCR 導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測(cè)4 個(gè)耳聾基因13 個(gè)位點(diǎn)（見(jiàn)表1），雜交程序按照生產(chǎn)廠家說(shuō)明進(jìn)行。耳聾基因篩查陽(yáng)性指13 個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)任一個(gè)位點(diǎn)突變，反之為陰性。

1.5 Sanger 測(cè)序法在Applied Biosystems 3500 Dx基因分析儀（Applied Biosystems by Life Technologies，Japan）中使用BigDye Terminator v3.1（Applied Biosystems by Life Technologies，USA）循環(huán)測(cè)序試劑盒。用生物信息學(xué)軟件Alamut Visual 2.11進(jìn)行比對(duì)和注釋，檢測(cè)到的序列與NCBI 所提供線粒體基因參考序列（NC_01292）進(jìn)行比對(duì)和注釋，突變的表述參照Human Genome Variation Society(HGVS) version 15.11 進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用皮爾森卡方檢驗(yàn)比較兩組間計(jì)數(shù)資料的差異，例數(shù)小于5 時(shí)采用確切概率法計(jì)算卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聽(tīng)力初篩結(jié)果 初篩第一階段總陽(yáng)性率5.51%（371/6738）,男嬰6.24%(226/3620),女嬰4.65%(145/3118)，男嬰高于女嬰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.17，P＜0.05）。初篩第一階段未通過(guò)者在42d 內(nèi)接受復(fù)篩，初篩第二階段總陽(yáng)性率11.32%(42/371)，男嬰10.62%(24/226)，女嬰12.41%(18/145)，男嬰與女嬰無(wú)差異(χ2=0.28，P＞0.05),聽(tīng)力篩查總陽(yáng)性率0.62%(42/6738)，男嬰0.66% (24/3620)，女嬰0.58% (18/3118)，男嬰與女嬰d 無(wú)差異（χ2=0.19，P＞0.05）見(jiàn)表2。

2.2 耳聾基因篩查結(jié)果 突變總攜帶率3.01%(203/6738)，含復(fù)合雜合突變2例，均為GJB2 合并SLC26A4 雜合突變；4 個(gè)基因突變率從高到低依次是GJB2 為1.44%(97/6738)、SLC26A4 為1.34%(90/6738)、mtDNA 為0.19%(13/6738)和GJB3 為0.07%(5/6738)。突變位點(diǎn)頻率前6 位依次為c.235delC、IVS7-2A>G、m.1555A>G、c.1229C＞T、c.2168A>G及c.299delAT。突變位點(diǎn)攜帶率在不同性別的分布無(wú)顯著性差異（χ2=0.34，P＞0.05），其中GJB3基因突變攜帶率男女之間分布無(wú)顯著差異（χ2=2.41，P＞0.05），見(jiàn)表3、圖1。

圖1 6738例新生兒13 個(gè)耳聾基因位點(diǎn)篩查突變情況

2.3 Sanger 測(cè)序結(jié)果通過(guò)Sanger 測(cè)序法檢測(cè)19例PCR 導(dǎo)流雜交技術(shù)未能明確突變的嬰兒，送試劑廠家檢測(cè)。結(jié)果顯示:19例嬰兒均為線粒體12sRNA 或tRNA的均質(zhì)型突變者，其中致病突變4例（m.7444G>A 2例、m.7443G>A 2例），良性突變10例（m.1503G>A 8例、m.12193A>G 2例），致病性未明突變5例（m.7433C>T 3例、m.7419G>A 1例、m.12196C>T 1例），見(jiàn)圖2。

圖2 線粒體基因中2 種致病性未明的突變。（A）代表正?；虻囊吧蚼tDNA G.7445A＞G（上圖，起始位置使用紅框標(biāo)注）和代表突變基因的均質(zhì)型mtDNA m.7433C>T（下圖，突變位置使用紅框標(biāo)注）。（B）代表正?；虻囊吧蚼tDNA G.12201T＞C（上圖，起始位置使用紅框標(biāo)注）和代表突變基因的均質(zhì)型mtDNA m.12196C>T（下圖，突變位置使用紅框標(biāo)注）。

2.4 廣東省內(nèi)各市新生兒耳聾基因篩查情況 廣東省其它地市新生兒耳聾基因篩查數(shù)據(jù)[5-16]，結(jié)果顯示：河源市耳聾基因總攜帶率為3.04%（此處總攜帶率按各耳聾基因相加得出），廣東省3.70%、廣州市3.68%、深圳市4.38%、佛山市3.08%、東莞市3.39%、中山市3.64%、珠海市4.11%、江門市3.69%、茂名市3.07%、陽(yáng)江市4.30%、韶關(guān)市3.93%、清遠(yuǎn)市2.64%及梅州市4.88%，各市間耳聾基因總體攜帶率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝105.89，P<0.05）。河源市總體攜帶率低于廣東省平均水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.84，P<0.05）。各地市4 個(gè)耳聾基因攜帶率從高到低依次均為GJB2、SLC26A4、12SrRNA和GJB3,河源市4 個(gè)耳聾基因分布情況與其他市一樣。河源市GJB2、SLC26A4、12SrRNA和GJB3分布百分比分別為47.32%、43.90%、6.34%、2.44%,廣東省GJB2、SLC26A4、12SrRNA和GJB3 分布百分比分別為53.91%、34.78%、6.26%、5.05%，兩者GJB2、SLC26A4和GJB3 分布百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝59.94，P<0.05；χ2＝42.06，P<0.05；χ2＝56.15，P<0.05）。河源人群中SLC26A4 百分比高于廣東省人群水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.18，P<0.05），GJB2、GJB3 百分比低于廣東省人群水平，提示河源地區(qū)耳聾基因篩查中需提高防范SLC26A4基因突變意識(shí)，見(jiàn)圖3。

圖3 廣東省內(nèi)各地市新生兒耳聾基因篩查情況。

2.5 聽(tīng)力與耳聾易感基因聯(lián)合篩查結(jié)果聯(lián)合篩查陽(yáng)性以聽(tīng)力篩查、耳聾易感基因篩查結(jié)果任意一項(xiàng)陽(yáng)性判定為陽(yáng)性,作為聽(tīng)力損失新生兒或高危新生兒。聯(lián)合篩查陽(yáng)性率3.58%(241/6738)、聽(tīng)力篩查陽(yáng)性率0.62%（42/6738），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=142.94，P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 聽(tīng)力與耳聾易感基因聯(lián)合篩查新生兒聽(tīng)力損失效能（例）

3 討論

新生兒聽(tīng)力與基因聯(lián)合篩查模式理念是2007年由王秋菊[17]等首次提出。新生兒聽(tīng)力篩查是通過(guò)多種客觀的篩查措施進(jìn)行早期檢測(cè)新生兒聽(tīng)力損失，一直以來(lái)是人們研究的方向。從主觀評(píng)價(jià)研究（行為觀察測(cè)聽(tīng)、視覺(jué)強(qiáng)化測(cè)聽(tīng)) 上升到OAE和AABR 等客觀測(cè)量,近年來(lái)發(fā)展到通過(guò)PCR 導(dǎo)流雜交法、微陣列芯片法、全基因組測(cè)序等從基因水平篩查。主觀評(píng)價(jià)高度依賴于檢測(cè)人員的技能且容易受兒童的成熟年齡影響。OAE和AABR 利用測(cè)量聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位客觀確定聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的功能狀態(tài),不僅降低操作人員專業(yè)能力的要求，并可在任何年齡進(jìn)行。Berg[18]比較OAE 后AABR的傳統(tǒng)方案與AABR 后OAE 兩種篩查方案，發(fā)現(xiàn)OAE 后AABR的傳統(tǒng)方案在時(shí)間方面更有效。發(fā)展中國(guó)家多在第一階段進(jìn)行OAE，在第二階段進(jìn)行AABR。相比之下,發(fā)達(dá)國(guó)家多采用兩個(gè)階段均進(jìn)行OAE和AABR 篩查。我市采用兩階段篩查方案，第一階段進(jìn)行OAE 初篩,第二階段進(jìn)行OAE和AABR 篩查。我們研究顯示，初篩第一階段總陽(yáng)性率5.51%，男嬰6.24%，女嬰4.65%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.17，P＜0.05）?？紤]到新生兒出生時(shí)可能存在耳道堵塞、鼓室內(nèi)有羊水、外耳道狹窄、新生兒喉鳴聲干擾等現(xiàn)象。初篩第一階段未通過(guò)者42 天內(nèi)接受復(fù)篩,初篩第二階段總陽(yáng)性率11.32%,排除了329名初篩第一階段假陽(yáng)性新生兒。與以往的研究一致,將AABR 納入新生兒篩查項(xiàng)目可有效獲得更好的聽(tīng)力篩查結(jié)果[19]。此外聽(tīng)力初篩總陽(yáng)性率為0.6 2%，低于國(guó)內(nèi)其它研究[20]。

本研究共分析6738例新生兒，耳聾基因攜帶率3.01%(203/6738)，低于廣東省其它市報(bào)道的攜帶率[6-17]。本研究發(fā)現(xiàn)河源人群SLC26A4基因百分比為43.90%，高于廣東省人群百分比水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.18，P<0.05）。位于7 號(hào)染色體上的SLC26A4基因編碼一種轉(zhuǎn)運(yùn)跨膜蛋白,對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)氯化物-碘化物和調(diào)節(jié)淋巴內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，該基因突變可能破壞耳蝸的離子穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致聽(tīng)力喪失[21]。已有強(qiáng)有力的證據(jù)表明c.1229C＞T和c.2168A＞G 突變與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)張相關(guān)[22]。有報(bào)道指出在亞洲非綜合征型耳聾患者中,中國(guó)人SLC 26A4基因IVS7-2A>G 突變的風(fēng)險(xiǎn)增加[23]，研究提示河源地區(qū)耳聾基因篩查中需提高防范SLC26A4基因突變意識(shí)，生活中盡量避免感冒、頭部撞擊等情況發(fā)生。此外，線粒體DNA(mtDNA)引起的耳聾又稱為藥物性耳聾，mtDNA 上12SrRNA和tRNA的變異可引起以母系遺傳為主的遺傳性耳聾，其中12SrRNA 變異相對(duì)常見(jiàn),河源人群中12SrRNA突變基因百分比為6.34%，檢出均質(zhì)型藥物性耳聾基因攜帶者10 名，若遵循醫(yī)囑避免相關(guān)氨基糖苷類藥物使用，將避免藥物性耳聾的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)19例非常見(jiàn)耳聾易感基因位點(diǎn)突變，均為mtDNA均質(zhì)型突變攜帶者，其中致病突變4例（m.7444G>A 2例、m.7443G>A 2例），良性突變10例（m.1503G>A 8例、m.12193A>G 2例），致病性未明突變5例（m.7433C>T 3例、m.7419G>A 1例、m.12196C>T 1例）。劉玲[24]等人發(fā)現(xiàn)廣東省694例非綜合征型耳聾患者GJB2、SLC26A4基因共有75種變異，其中46 個(gè)致病性突變，29 個(gè)意義不明。由此可見(jiàn)廣東省非綜合征耳聾基因突變譜需進(jìn)一步完善，本研究提供2 個(gè)潛在致病位點(diǎn)，為建立廣東省出生缺陷臨床防控模式提供寶貴資料。

本研究將聯(lián)合篩查結(jié)果任意一項(xiàng)陽(yáng)性判定為陽(yáng)性，作為聽(tīng)力損失新生兒或高危新生兒。由研究表明[25]，聯(lián)合篩查有重要臨床實(shí)踐意義。本研究與其它地市結(jié)果一致,新生兒聽(tīng)力和耳聾基因聯(lián)合篩查在河源地區(qū)開(kāi)展有良好臨床效益與社會(huì)效益，一方面聽(tīng)力損失的基因檢測(cè)可以幫助避免不必要和昂貴的臨床檢測(cè)，提供預(yù)后信息并對(duì)未來(lái)社會(huì)婚育提供科學(xué)的遺傳指導(dǎo)。另一方面，隨著基因治療技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，有望在未來(lái)緩解或逆轉(zhuǎn)由遺傳原因?qū)е碌穆?tīng)力損失。