核桃粕多肽的制備及其抗氧化活性研究

弘子姍 解靜 張寶娟 代晶晶 陶亮 田洋

摘要以云南大理漾濞核桃粕為原料，提取核桃蛋白，采用7種蛋白酶對核桃蛋白進(jìn)行單酶水解，以抗氧化能力為指標(biāo)，對不同酶解產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行酶的優(yōu)選。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過四因素三水平正交試驗對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并驗證其酶解產(chǎn)物抗氧化活性。堿性蛋白酶為酶解核桃蛋白的最優(yōu)選擇;核桃蛋白的最佳酶解工藝為加酶量300 U/mL、pH 10、酶解溫度50℃、酶解時間3.5 h，在此條件下，多肽得率為80.34%，制備出的多肽具有較強的抗氧化活性。核桃多肽作為良好的天然抗氧化劑有進(jìn)一步開發(fā)利用的潛力，本研究為提升核桃副產(chǎn)物的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞核桃蛋白;多肽;堿性蛋白酶;工藝優(yōu)化;抗氧化活性

中圖分類號 S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.12.008

Preparation of Polypeptides from Walnut Dregs and Their Antioxidant Activity

HONG? Zishan1 ，2） XIE? Jing2 ，3 ，4） ZHANG? Baojuan1） DAI Jingjing1 ，2）TAO? Liang1 ，2 ，3 ，4） TIAN? Yang1 ，2 ，3 ，4）

（1 College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China;

2 National Research Center for Moringa Processing Technology， Kunming， Yunnan 650201， China;

3 Engineering Center for Development and Utilization of Edible and Medicinal Resources， Ministry of Education，? Kunming， Yunnan 650201， China;

4 Yunnan Engineering Research Center for Development of Functional Food from Edible and Medicinal Resources， Kunming， Yunnan 650201， China）

Abstract? Walnut proteins were extracted from walnut dregs， and hydrolyzed by 7 proteases to select an optimum? protease? based? on? the? antioxidant? activity? of? different? enzymatic? hydrolysates? with? the antioxidant capacity as an indicator. Single factor test was followed by four-factor three-level orthogonal test? to? optimize? the? enzymatic? hydrolysis? process，? and? the? antioxidant? activities? of? the? enzymatic hydrolyzed? products? were? then? verified. The? results? showed? that? alcalase? is? the? best? protease? for enzymatic hydrolysis of walnut protein. The optimal enzymatic hydrolysis conditions for walnut protein are 300 U·mL-1 ， pH? value 10，? enzymatic hydrolysis? temperature 50°C，? and? enzymatic hydrolysis? time 3.5 h. Under these conditions the yield of the polypeptides is 80.34%， and the polypeptides shows strong antioxidant? activity. As? a? natural? antioxidant，? walnut? polypeptides? have? great? potential? for? furtherdevelopment? and? utilization. This? study? provides? data? and? theoretical? support? for? improving? the development and utilization of walnut by-products.

Keywords? walnut protein ; peptide ; alcalase ; technology optimization ; antioxidant activity

核桃（Juglans regiaL.）又名胡桃、羌桃，為胡桃科胡桃屬植物，與扁桃、開心果、榛子并列為世界著名四大干果[1-2]，是世界上最古老的堅果，原產(chǎn)于東亞、東南歐和北美[3-4]。核桃有“長壽果”和“養(yǎng)生之寶”的美譽[5]，被列入藥食同源名單，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多種氨基酸、糖類物質(zhì)和微量元素，以及對人體有效的活性物質(zhì)[6-7]，深受消費者青睞。核桃是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源[8]。核桃蛋白肽含有較高的營養(yǎng)價值，而且核桃蛋白酶解物還呈現(xiàn)較高的活性，包括抗衰老、預(yù)防神經(jīng)退變、強身補腦、增強記憶力[9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11]、抗炎[12]、降低膽固醇[13-14]、降血壓和降低心血管疾病風(fēng)險[15]等。因此，核桃作為食源性原料具有較高的藥用價值和開發(fā)前景。

目前，核桃深加工產(chǎn)品主要以生食和粗加工的產(chǎn)品為主，粗加工產(chǎn)品主要以核桃油為主[16]，而在核桃油的生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的下腳料核桃粕，其蛋白質(zhì)含量較高，品質(zhì)較優(yōu)，氨基酸的種類齊全，具有較高的營養(yǎng)價值和相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)的潛力。然而，目前對核桃加工之后產(chǎn)生的副產(chǎn)物資源利用尚不夠充分，很多核桃加工企業(yè)把核桃粕作為肥料和飼料或丟棄[17]。因此，加強核桃和核桃副產(chǎn)物的深度開發(fā)研究對核桃產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

本文以核桃粕為原料，提取核桃蛋白，采用7種蛋白酶對核桃蛋白進(jìn)行單酶水解，以 ABTS 自由基清除能力、鐵離子還原能力（ FARP）、 DPPH 自由基清除能力、羥基自由基清除能力為指標(biāo)，對不同酶解產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行酶的優(yōu)選。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、酶解時間、酶添加量、pH 為自變量，通過四因素三水平正交試驗對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，制備高抗氧化活性核桃多肽，以期為提升核桃粕的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材

核桃粕，大理云上普瑞農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司;堿性蛋白酶（20萬 U/g）、胰蛋白酶（25萬 U/g）、胃蛋白酶（30萬 U/g）、木瓜蛋白酶（8萬 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（3萬 U/g）、糜蛋白酶（10萬 U/g）、中性蛋白酶（5萬 U/g），索萊寶科技有限公司; DPPH，索萊寶科技有限公司;TPTZ，阿拉丁試劑有限公司; ABTS，美國 Sigma公司;無水乙醇、過硫酸鉀、乙酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、三氯化鐵等均為分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備

DFT-100型手提式高速中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司; TDL-5-A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司;80-2型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-1800型紫外可見分光光度計，上海翱藝儀器有限公司;Bio-Tek Synergy H4全功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器。

1.2方法

1.2.1核桃蛋白的提取

取500 g核桃粕通過粉碎機(jī)磨碎，加入1 L石油醚浸泡脫脂，3 000 r/min 離心10 min，回收石油醚，將脫脂核桃蛋白粉放通風(fēng)櫥中干燥。將脫脂蛋白粉以1∶15（ W/V）的比例分散在 NaOH 溶液（pH 9.0）中，并在45℃攪拌1 h 萃取。用1 mol/L 的 HCl 調(diào)節(jié)上清液 pH 至4.5后， 4000 r/min 離心20 min獲得沉淀物冷凍干燥，并保存在-20℃中。

1.2.2酶法制備核桃多肽

1.2.2.1蛋白酶篩選

將核桃蛋白以5%的濃度溶于蒸餾水中，100℃沸水浴15 min，用 NaOH、HCl調(diào)節(jié)最適 pH，加入酶在最適溫度水解4 h，根據(jù)表1不同蛋白酶最適條件進(jìn)行酶解。然后在100℃的沸水浴中加熱15 min 使酶失活，上清液調(diào)至中性，將樣品以4000 r/min 離心15 min，然后將上清液冷凍干燥，測定抗氧化活性。

1.2.2.2單因素試驗

選擇抗氧化活性最優(yōu)的蛋白酶進(jìn)行優(yōu)化，以多肽得率為評價指標(biāo)，考察加酶量（200、250、300、350、400 U/mL）、酶解 pH （7.0、8.0、9.0、10、11）、酶解溫度（45、50、55、60、65℃）、酶解時間（2、3、4、5、6 h）對多肽得率的影響，固定底物濃度為1 mg/mL，確定核桃多肽水解的最佳因素水平。

1.2.2.3正交設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果確定各因素的合理水平，詳見表2。選用 L9（34）正交表安排實驗。

1.2.3多肽得率的測定

采用比色法[18-19]測定多肽得率，用 10%的三氯乙酸（ TCA）依次配制0.0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別取2 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液、加入8 mL 雙縮脲試劑，混合均勻，靜置30 min，取上清液于540 nm 下測定 OD值。以肽濃度為橫坐標(biāo) X（mg/mL）， OD值為縱坐標(biāo) Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.0346 x+0.0012，R?=0.9923。

取2 mL 樣品溶液，加入2 mL 10%（ W/V）的三氯乙酸（ TCA）溶液，混勻靜置30 min 后，再于4000 r/min離心15 min，取上清液2 mL，加入雙縮脲試劑8 mL，室溫下靜置30min，于540 nm 下測定OD值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的多肽濃度 c （mg/mL），可求得樣品中多肽含量。

1.2.4抗氧化活性測定

對樣品溶液進(jìn)行 DPPH 自由基清除能力[20]、 ABTS 自由基清除能力[21]、FRAP測定[22]、羥基自由基清除能力[23]進(jìn)行測定以評價其抗氧化活性。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

利用 Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用正交助手3.1進(jìn)行正交分析，利用 SPSS 19.0進(jìn)行方差顯著性分析，利用Graghpad Prism 6.0進(jìn)行做圖。所有實驗重復(fù)3次以上，計算平均值，結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示。

2結(jié)果與分析

2.1最適蛋白酶的選擇

常用的核桃蛋白水解酶有胃蛋白酶[24]、胰蛋白酶[25]、堿性蛋白酶[26]、木瓜蛋白酶[27]、中性蛋白酶[28]、糜蛋白酶[29]、風(fēng)味蛋白酶等。酶作為具有生理活性的特殊蛋白，具有不同的活化中心和水解特異性。同一種蛋白質(zhì)可以選擇不同的蛋白酶進(jìn)行水解，水解效果不同，所制備出來的多肽抗氧化能力強弱也不同。以 ABTS 自由基清除能力、鐵離子還原能力（ FARP）、 DPPH 自由基清除能力、羥基自由基清除能力為指標(biāo)，對不同酶解產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行酶的優(yōu)選。

7種蛋白酶酶解物的抗氧化能力如圖1所示。在同等濃度下，堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶 DPPH 自由基清除能力最強（p<0.05），其次為糜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶最弱。堿性蛋白酶 ABTS 自由基清除能力最強（p <0.05），不同酶解物 ABTS 自由基清除能力強弱依次為堿性蛋白酶>糜蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶。木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶鐵離子還原能力最強（p<0.05），其次為糜蛋白酶，中性蛋白酶最弱。不同酶解物羥基自由基清除能力為胰蛋白酶>堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶>糜蛋白酶>中性蛋白酶>胃蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶?？傮w來看，胰蛋白酶和堿性蛋白酶羥基自由基清除能力較強，顯著高于其他蛋白酶（p<0.05）。

總體而言，堿性蛋白酶表現(xiàn)出較強的抗氧化能力。因此，選擇堿性蛋白酶作為后續(xù)酶解的蛋白酶。

2.2酶解工藝優(yōu)化

2.2.1加酶量對多肽得率的影響

由圖2可知，多肽得率隨著酶添加量的增加呈現(xiàn)先急劇上升后趨于平緩的趨勢。當(dāng)加酶量達(dá)到300 U/mL 時，多肽得率達(dá)到（74.95±1.24）%，而后繼續(xù)增加蛋白酶量，多肽得率變化差異不顯著。原因可能是當(dāng)加酶量達(dá)到300 U/mL 時，蛋白底物已充分被酶水解，此時再增加相應(yīng)蛋白酶，多肽得率不變?？紤]酶解消耗成本等因素，確定加酶量為300 U/mL。

2.2.2 pH 對多肽得率的影響

如圖3所示，隨著酶解 pH 的增加，多肽得率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶解 pH 達(dá)到10時，核桃蛋白的多肽得率達(dá)到最大值，為（75.64±1.73）%，差異顯著;當(dāng)酶解 pH繼續(xù)上升至11時，多肽得率反而下降。因此，選用 pH 為10為堿性蛋白酶水解核桃蛋白最優(yōu)的酶解 pH。

2.2.3酶解時間對多肽得率的影響

由圖4可知，多肽得率隨著酶解時間的增長，整體上呈先急劇上升后平緩上升的趨勢。當(dāng)酶解時間為4 h 時，多肽得率達(dá)到（75.93±0.79）%，繼續(xù)延長酶解時間，多肽得率雖呈增加趨勢，但差異不顯著。因此，酶解4 h 為堿性蛋白酶水解核桃蛋白最優(yōu)的酶解時間。

2.2.4酶解溫度對多肽得率的影響

由圖5可知，隨著酶解溫度的升高，核桃蛋白的多肽得率呈先上升后下降的趨勢，且當(dāng)酶解溫度為50℃時，多肽得率達(dá)到了最大值（75.53±0.52）%，此后，隨著溫度的升高，多肽得率反而下降。因此，選擇酶解溫度為50℃。

2.3正交實驗分析結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以多肽得率為優(yōu)化指標(biāo)，選取加酶量（ A）、 pH （ B）、酶解溫度（C）和酶解時間（D）進(jìn)行四因素三水平 L9（34）正交優(yōu)化試驗來確定最佳提取參數(shù)，結(jié)果見表3，并對多肽得率進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果如表4所示。

由表3可知，各實驗因素對多肽得率的影響表現(xiàn)出一定的差異性。影響多肽得率的因素主次為 B >D>A>C，即 pH 為本實驗的主要影響因素，酶解時間次之，加酶量對多肽得率的影響相對較少，酶解溫度的影響最小。最終得出，核桃多肽提取的最佳工藝條件為 A2B2C3D1，即加酶量300 U/mL、pH 10、酶解溫度55℃、酶解時間3.5 h，在此條件下進(jìn)行3次驗證實驗。結(jié)果多肽的得率為（80.34±1.36）%，與優(yōu)化前的多肽得率相比有明顯的提高，說明該組參數(shù)為最優(yōu)的工藝條件。

2.4核桃抗氧化肽的抗氧化活性評價

2.4.1核桃抗氧化肽 DPPH 自由基清除能力

由圖6可知，樣品表現(xiàn)出一定的 DPPH 自由基清除活性，且活性隨著樣品濃度水平的提高而顯著上升。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 g/mL 時，核桃抗氧化肽的 DPPH 自由基清除能力達(dá)到（87.21±2.07）%，在相同濃度下，陽性對照抗壞血酸的清除率達(dá)（94.11±1.36）%。

2.4.2核桃抗氧化肽 ABTS 自由基清除能力

以抗壞血酸作陽性對照，樣品濃度與核桃抗氧化肽 ABTS 自由基清除能力的變化情況如圖7。由圖7可知，抗壞血酸和核桃抗氧化肽的 DPPH 自由基清除能力隨著樣品濃度的增加而上升，且差異顯著，當(dāng)樣品濃度達(dá)到0.5 g/mL 時，抗壞血酸 ABTS 自由基清除能力為（97.33±1.84）%;核桃抗氧化肽的 ABTS 自由基清除能力為（ 84.2±1.31）%。

2.4.3核桃抗氧化肽羥基自由基清除能力

以抗壞血酸作陽性對照，樣品濃度與核桃抗氧化肽羥基自由基清除能力的變化情況如圖8。由圖8可知，抗壞血酸和核桃抗氧化肽的羥基自由基清除能力隨著樣品濃度的增加而上升，當(dāng)樣品濃度達(dá)到0.5 g/mL 時，抗壞血酸羥基自由基清除能力為（98±2.5）%;核桃抗氧化肽的羥基自由基清除能力為（82.2±2.2）%。

2.4.4核桃抗氧化肽 Fe3+還原能力

樣品濃度與核桃抗氧化肽 Fe3+還原能力的變化情況如圖9。由圖9可知，抗壞血酸和核桃抗氧化肽的 Fe3+還原能力隨著樣品濃度的增加而上升，當(dāng)樣品濃度達(dá)到0.5 g/mL 時，抗壞血酸 Fe3+還原能力為（ 53.18±3.26）%;核桃抗氧化肽的 Fe3+還原能力為（44.74±4.24）%。

3結(jié)論

本實驗利用酶解法提取核桃多肽，探索其多肽的抗氧化活性，篩選出堿性蛋白酶為最適工具酶，通過單因素正交試驗確定核桃蛋白最佳酶解條件為：加酶量300 U/mL、pH 10、酶解溫度50℃、酶解時間3.5 h，在此條件下多肽的得率為80.34%，制備出的多肽 DPPH、ABTS、羥基自由基清除率、鐵離子還原能力達(dá)（ 87.21±2.07）%、（84.20±1.31）%、（82.20±2.20）%、（44.74±4.24）%，表明核桃多肽抗氧化效果顯著，具有較高的開發(fā)潛力。

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（編輯排版：龍婭麗）