利用豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)行板層角膜移植手術(shù)治療感染性角膜炎的臨床研究

范祥雨 黃霏霏 張朝然 徐建江 項(xiàng)俊

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031)

感染性角膜炎是我國(guó)主要的致盲性角膜病[1-2]。對(duì)于藥物治療無(wú)效的感染性角膜病變，角膜移植手術(shù)是控制感染和重建眼表的必要手段[3-4]。對(duì)于病灶局限于前或中基質(zhì)的感染性角膜炎患者，深板層角膜移植術(shù)(deep lamellar keratoplasty，DALK)顯示出其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[5-6]。目前，角膜移植手術(shù)的供體材料主要來(lái)源于同種異體角膜，而捐獻(xiàn)的供角膜匱乏嚴(yán)重阻礙了角膜盲患者的復(fù)明[7]。因此，近年來(lái)各類(lèi)新型角膜替代物材料一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。生物工程角膜是將豬角膜組織經(jīng)脫細(xì)胞、去抗原和病毒等生物技術(shù)處理后制成的角膜基質(zhì)材料，可在一定程度上替代人角膜應(yīng)用于臨床，緩解供體緊缺的局面。本研究采用該材料對(duì)感染性角膜病患者行板層角膜移植術(shù)并觀(guān)察其術(shù)后臨床效果，現(xiàn)將已完成觀(guān)察的15例患者結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料 采用前瞻性系列病例觀(guān)察的研究設(shè)計(jì)，收集2018年5月~2019年4月在本院就診、經(jīng)藥物治療無(wú)效的15例感染性角膜炎患者，其中女性5例、男性10例；年齡41~71歲，平均(58.13±9.40)歲。12例確診為真菌性角膜炎，2例臨床診斷為病毒性角膜炎，1例確診為銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)性角膜炎。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18~80歲；診斷為感染性角膜病者；按病因或經(jīng)驗(yàn)正規(guī)用藥1~3 周，感染未得到控制的患者；病灶位于瞳孔區(qū)，范圍為 4.0~8.5 mm，累及角膜基質(zhì)，但尚未累及后彈力層角膜者；術(shù)前最佳矯正視力(best-corrected visual acuity，BCVA)＜0.05者。排除標(biāo)準(zhǔn)：全身情況差，不能耐受手術(shù)者；角膜穿孔嚴(yán)重者；嚴(yán)重干眼癥或眼瞼閉合不全者；嚴(yán)重的過(guò)敏體質(zhì)或?qū)υ囼?yàn)材料過(guò)敏者；合并有感染性眼內(nèi)炎者，單眼患者或?qū)?cè)眼視力喪失者。試驗(yàn)已通過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者術(shù)前均簽署手術(shù)知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 材料 生物角膜植片由廣州悅清再生醫(yī)學(xué)科技有限公司提供，僅供本次臨床研究應(yīng)用。

1.2.2 手術(shù)步驟 選擇一次性角膜環(huán)鉆，環(huán)鉆直徑至少大于病灶0.5 mm，鉆切深度約為角膜厚度的3/4，從周邊開(kāi)始進(jìn)行角膜剖切。如一次剖切不能切除病灶，可進(jìn)行多次剖切直至植床透明。取400 μm厚的生物角膜植片，直徑比植床大0.25~0.5 mm，10-0尼龍線(xiàn)間斷縫合12~16針。確診為真菌感染者，術(shù)中使用伏立康唑溶液沖洗植床。術(shù)后根據(jù)病情需要予其局部使用他克莫司滴眼液，4次/d；病毒性角膜炎使用更昔洛韋凝膠，4次/d；銅綠假單胞菌性角膜炎使用左氧氟沙星滴眼液和妥布霉素滴眼液，1次/h；真菌性角膜炎予以局部使用0.5 % 伏立康唑滴眼液(院內(nèi)自制制劑)及5 % 納他霉素滴眼液(那特真，Alcon公司)0.5~1 h 1次。觀(guān)察2~4周后如無(wú)感染復(fù)發(fā)，局部加用妥布霉素地塞米松滴眼液(典必殊，Alcon公司)滴眼3~4次/d。

1.2.3 觀(guān)察指標(biāo) 于術(shù)后1 d、1周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)復(fù)診。復(fù)診時(shí)行BCVA、裂隙燈顯微鏡、眼壓、眼前節(jié)光學(xué)相干層析成像（optical coherence tomography，OCT；Tomey，日本 ) 及共聚焦顯微鏡(ZEISS，德國(guó))檢查。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①角膜植片透明度，0級(jí)為透明；1級(jí)為輕度混濁，能看清虹膜紋理；2級(jí)為中度混濁，部分虹膜紋理不清；3級(jí)為嚴(yán)重混濁，虹膜紋理完全看不清。②角膜新生血管，0級(jí)為無(wú)新生血管；1級(jí)為受體角膜出現(xiàn)新生血管；角膜植片無(wú)新生血管；2級(jí)為角膜植片周邊出現(xiàn)新生血管，但未累及中央?yún)^(qū)；3級(jí)為角膜植片中央出現(xiàn)新生血管。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 脫盲率計(jì)算公式：脫盲率=BCVA≥0.05的病例數(shù)/總病例數(shù)。為了便于統(tǒng)計(jì)分析，將BCVA轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)logMAR視力。采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。手術(shù)前后不同時(shí)間點(diǎn)的角膜植片透明度和新生血管評(píng)分的總體差異比較采用Friedman檢驗(yàn)，比較患眼術(shù)前和術(shù)后的視力均值采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后感染控制情況 術(shù)后6個(gè)月，15例患者15眼角膜感染均得到控制，無(wú)復(fù)發(fā)情況。感染控制率為100%。

2.2 術(shù)后植片透明度及新生血管長(zhǎng)入情況 術(shù)前及術(shù)后不同隨訪(fǎng)時(shí)間點(diǎn)間角膜植片透明度評(píng)分的總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.43，P<0.01)。裂隙燈顯微鏡下觀(guān)察，術(shù)后角膜植片隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸變得透明(圖1)。術(shù)前除1例植片外，14例植片均為重度混濁。術(shù)后1～3個(gè)月的隨訪(fǎng)中，呈重度混濁的植片例數(shù)逐漸減少。至術(shù)后6個(gè)月，已有3例完全透明、5例輕度混濁、6例中度混濁、僅1例呈重度混濁（圖2）。術(shù)前及術(shù)后不同隨訪(fǎng)時(shí)間點(diǎn)間角膜新生血管評(píng)分的總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.05，P=0.026)。至術(shù)后6個(gè)月，15例患者中13例新生血管評(píng)分與術(shù)前相比維持不變或降低，僅2例新生血管長(zhǎng)入情況加重（圖3）。

圖1 1例真菌性角膜炎患者行豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)治療前后裂隙燈顯微鏡照片 A.術(shù)前可見(jiàn)角膜中央直徑約4 mm的瓷白色病灶，可見(jiàn)前房積膿；B.術(shù)后1周可見(jiàn)結(jié)膜充血，角膜植片混濁水腫；C.術(shù)后1個(gè)月可見(jiàn)結(jié)膜充血減退，角膜植片混濁水腫減輕；D～E.術(shù)后2～3個(gè)月，角膜植片無(wú)水腫，虹膜紋理清；F.術(shù)后6個(gè)月，角膜植片完全透明。

圖2 術(shù)前及術(shù)后各隨訪(fǎng)時(shí)間點(diǎn)的角膜透明性評(píng)分構(gòu)成情況

圖3 術(shù)前及術(shù)后各隨訪(fǎng)時(shí)間點(diǎn)的角膜新生血管評(píng)分構(gòu)成情況

2.3 視力結(jié)果 患者術(shù)前、術(shù)后1個(gè)月、術(shù)后2個(gè)月、術(shù)后3個(gè)月和術(shù)后6個(gè)月行視力檢查，平均視力（logMAR）分別為2.08±0.45、1.92±0.50、1.71±0.51、1.52±0.62、1.13±0.46。術(shù)后3個(gè)月及術(shù)后6個(gè)月的平均視力與術(shù)前相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.954，P=0.012；t=8.093，P<0.01)。至術(shù)后6個(gè)月，15例患者中有13例視力達(dá)脫盲標(biāo)準(zhǔn)，脫盲率為86.7 %（圖4）。

圖4 術(shù)前及術(shù)后BCVA變化情況 *示P<0.05，**示P<0.01。

2.4 術(shù)后前節(jié)OCT與共聚焦顯微鏡檢查 術(shù)后6個(gè)月，前節(jié)OCT檢查顯示患者術(shù)后植床和植片層間愈合良好，角膜厚度正常。共聚焦顯微鏡檢查顯示，術(shù)后6個(gè)月已可見(jiàn)植片內(nèi)有上皮下神經(jīng)纖維長(zhǎng)入；植片淺及深基質(zhì)層均探及基質(zhì)細(xì)胞（圖5）。

圖5 術(shù)前及術(shù)后前節(jié)OCT及共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果 A.術(shù)后6個(gè)月前節(jié)OCT結(jié)果顯示良好的層間愈合； B和C.術(shù)后6個(gè)月共聚焦顯微鏡檢查可探及角膜上皮下神經(jīng)纖維及基質(zhì)層基質(zhì)細(xì)胞。

2.5 術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥 在隨訪(fǎng)中，1例出現(xiàn)角膜上皮愈合延遲，1例出現(xiàn)角膜移植排斥，1例出現(xiàn)術(shù)后繼發(fā)性高眼壓，2例出現(xiàn)角膜縫線(xiàn)松脫。1例患者在術(shù)后1周內(nèi)角膜上皮未完全愈合，熒光素鈉染色呈陽(yáng)性，給予角膜接觸鏡佩戴治療1個(gè)月后上皮愈合良好。1例患者術(shù)后1個(gè)月出現(xiàn)角膜縫線(xiàn)松脫伴基質(zhì)型排斥反應(yīng)，拆除其松脫的縫線(xiàn)并給予頻繁糖皮質(zhì)激素滴眼，3 d后病情好轉(zhuǎn)；后持續(xù)給予抗排斥藥物治療，1個(gè)月后復(fù)查病情穩(wěn)定。1例患者在術(shù)后1個(gè)月出現(xiàn)繼發(fā)性眼壓升高，降眼壓藥物治療無(wú)效，行小梁切除術(shù)后指測(cè)眼壓恢復(fù)正常。隨訪(fǎng)期內(nèi)無(wú)一例發(fā)生植片脫落或溶解。

3 討論

同種異體板層角膜移植手術(shù)已廣泛應(yīng)用于感染性角膜炎的治療。積極的手術(shù)可以最大程度地清除感染灶，減少局部抗生素的使用，增加患者的依從性，有效縮短病程，促進(jìn)視力的恢復(fù)[8]。由于同種異體角膜材料的限制，很多患者得不到及時(shí)治療，而延誤最佳治療時(shí)機(jī)，造成難以挽回的損失。研發(fā)適合板層移植的新型替代材料是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。本研究中采用的生物工程角膜即豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)，是利用豬眼角膜經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞、去抗原和滅活病毒等工藝制備而成，保留了天然角膜膠原纖維結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞附著、移行和增生，引導(dǎo)基質(zhì)膠原合成及上皮再生，可逐漸被機(jī)體細(xì)胞所改建，具有良好的生物相容性[9]。

在我們觀(guān)察的系列病例中，術(shù)后6個(gè)月，15例患者15眼角膜感染均得到控制，感染控制率達(dá)100 %。同樣利用豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行板層手術(shù)，鄭欽象等[10]報(bào)道的20例患者術(shù)后6個(gè)月的感染控制率為95 %，劉志玲等[11]報(bào)道的44例患者術(shù)后12個(gè)月的感染控制率為91%。以往文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道同種異體角膜深板層移植術(shù)后的真菌性角膜炎復(fù)發(fā)率為7.6 %～20.0 %。因此可看出，用于板層角膜移植的生物工程角膜與同種異體角膜相比，并未加重感染復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，晚期復(fù)發(fā)(術(shù)后15～60 d)患者術(shù)前常合并前房積膿，真菌菌絲生長(zhǎng)旺盛；或與術(shù)后藥物減量及糖皮質(zhì)激素加用的時(shí)機(jī)選擇有關(guān)。這也可以解釋本研究中1例患者復(fù)發(fā)的可能原因。脫細(xì)胞基質(zhì)材料經(jīng)過(guò)特殊工藝處理，去除了細(xì)胞成分、降低了角膜的免疫原性，從而減少了術(shù)后發(fā)生炎癥反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)的概率[15-16]。本組15例患者中僅有1例發(fā)生了基質(zhì)型排斥反應(yīng)，并且在進(jìn)行了抗排斥藥物治療后排斥反應(yīng)得到控制。其余14例患者在隨訪(fǎng)期間均未發(fā)生排斥反應(yīng)且未見(jiàn)植片溶解或脫落。本研究顯示了較低排斥及復(fù)發(fā)發(fā)生率，進(jìn)一步證實(shí)了豬脫細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)用于治療感染性角膜炎的安全性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)患者術(shù)后視力在隨訪(fǎng)期間逐漸提高，術(shù)后3個(gè)月及6個(gè)月與術(shù)前相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后6個(gè)月的脫盲率為86.7 %。在鄭欽象等[10]的研究中，采用生物工程角膜治療感染性角膜炎的20例患者，術(shù)后1周植片水腫即消失，透明性明顯改善，視力顯著提高；術(shù)后6個(gè)月的脫盲率可達(dá)100%。而劉志玲等[11]則發(fā)現(xiàn)生物工程角膜術(shù)后1、3、6個(gè)月的植片透明度明顯低于同種異體角膜植片，直至術(shù)后12個(gè)月無(wú)顯著差異。Zhang等[17]的研究也顯示生物工程角膜在術(shù)后6個(gè)月～3年間逐漸變透明。這與本研究的結(jié)果相符合。我們猜測(cè)，生物材料板層角膜移植術(shù)后早期角膜植片透明度較差，可能是由于冷凍保存及材料使用前復(fù)水過(guò)程致水腫，隨著角膜內(nèi)皮泵功能恢復(fù)排出多余水分以及基質(zhì)材料在與角膜相容過(guò)程中不斷發(fā)生重構(gòu)，植片水腫可逐步消退，透明度可逐漸改善，視力將逐步提高。這說(shuō)明豬脫細(xì)胞基質(zhì)材料應(yīng)用于感染性角膜炎患者，不僅可控制感染，也可恢復(fù)患者受損的視功能，具備有效性。由于本研究觀(guān)察時(shí)間和樣本量的限制，對(duì)患者視力的遠(yuǎn)期效果及安全性評(píng)價(jià)還需要進(jìn)一步研究。

我們知道，角膜上皮下神經(jīng)不僅可以維持角膜上皮的健康和完整，還能調(diào)節(jié)眼表淚膜的分泌[18-19]。本研究通過(guò)共聚焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后6個(gè)月即可探及基質(zhì)材料中長(zhǎng)入的上皮下神經(jīng)纖維組織，該結(jié)果與前人的研究相似[20-21]。這似乎也解釋了術(shù)后早期易發(fā)生角膜上皮延遲愈合的原因。角膜移植后神經(jīng)再生和修復(fù)是眼表重建的基礎(chǔ)，術(shù)后早期植片內(nèi)未長(zhǎng)入上皮下神經(jīng)易引起持續(xù)性上皮缺損，需給予關(guān)注。與王素娟等[19]的研究結(jié)果不同，我們?cè)谛g(shù)后6個(gè)月通過(guò)共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)了豬脫細(xì)胞基質(zhì)材料內(nèi)出現(xiàn)了基質(zhì)細(xì)胞，對(duì)其生長(zhǎng)的作用和機(jī)制值得進(jìn)一步研究。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)2例移植術(shù)后角膜縫線(xiàn)松脫。有研究[11]認(rèn)為，生物工程角膜組由于術(shù)后早期復(fù)水植片組織的水腫較重，隨訪(fǎng)過(guò)程中植片水腫不斷減輕可導(dǎo)致發(fā)生縫線(xiàn)松脫的比例高于人供體角膜組。這也提示臨床工作者在術(shù)后隨訪(fǎng)過(guò)程中應(yīng)更加關(guān)注縫線(xiàn)的松脫情況并及時(shí)處理，避免發(fā)生縫線(xiàn)相關(guān)并發(fā)癥，增加感染及排斥的風(fēng)險(xiǎn)[22]。

總體而言，豬脫細(xì)胞基質(zhì)材料應(yīng)用于治療感染性角膜炎患者是安全、有效的。作為替代材料對(duì)患者進(jìn)行角膜移植可有效緩解同種異體角膜供體的匱乏，其遠(yuǎn)期臨床價(jià)值還需進(jìn)一步研究與探討。