程海洋 魏有海 郭良芝 程亮 郭青云

摘要：為明確從矮火絨草根內(nèi)分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)致馬鈴薯晚疫病病菌的抑制作用，采用稀釋平板法分離矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌，以對(duì)峙培養(yǎng)法和打孔法分別測(cè)試細(xì)菌菌株和發(fā)酵液濾液對(duì)晚疫病菌絲生長(zhǎng)和孢子囊萌發(fā)的抑制作用，并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，在分離的54株細(xì)菌中，有20株細(xì)菌對(duì)晚疫病病菌具明顯拮抗作用，有6 株抑菌率達(dá)80%以上。其中，KBL17和KBL8菌株對(duì)致病疫霉的抑菌率較高，分別為95.47%、88.37%;發(fā)酵濾液以KBL17和KBL6的抑菌率較高，分別為92.58%、83.21%，KBL17的孢子囊抑制率最高，為96.03%;盆栽試驗(yàn)中，細(xì)菌菌株發(fā)酵濾液處理能夠?qū)е峦硪卟〔∏橹笖?shù)下降，其中KBL17菌株防效最好，達(dá)到76.04%，低于化學(xué)藥劑嘧菌酯的防效（82.57%）。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，與化學(xué)殺菌劑（70.27%）相比，KBL17菌株對(duì)晚疫病的平均防效達(dá)到 67.45%。經(jīng)鑒定KBL17菌株為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。該菌株在馬鈴薯晚疫病防治中有較大潛力。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯晚疫病;致病疫霉;拮抗作用;鑒定;生物防治;內(nèi)生細(xì)菌

中圖分類號(hào)：S435.32?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）18-0116-06

收稿日期：2020-01-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018YFD020080505）;青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號(hào)：2020-ZJ-Y11、2021-ZJ-Y08）;青海省科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)（編號(hào)：2018-NK-105）;第二次青藏高原綜合科學(xué)考察研究項(xiàng)目（編號(hào)：2019QZKK0303）。

作者簡(jiǎn)介：程海洋（1997—），男，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，從事生物防治等研究工作。E-mail：haiyangcheng532@163.com 。

通信作者：程 亮，碩士，研究員，從事生物防治研究工作。E-mail：liangcheng1979@163.com。

馬鈴薯，屬茄科多年生草本植物，糧飼兼用，是全球第四大重要的糧食作物，僅次于水稻、小麥和玉米，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)保障糧食安全和社會(huì)發(fā)展的重要支柱[1-2]。馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉（Phytophora infestans）引起并導(dǎo)致馬鈴薯莖葉死亡和塊莖腐爛的一種毀滅性真菌病害，常導(dǎo)致馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收，造成全球重大經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前，使用化學(xué)殺菌劑是防治馬鈴薯晚疫病的有效方法[4-5]，但頻繁使用殺菌劑對(duì)環(huán)境和人類健康均有不利影響，易造成病原菌抗（耐）藥性越來(lái)越強(qiáng)[6]，同時(shí)加速了馬鈴薯晚疫病病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)生理分化和變異[7]。青海省是馬鈴薯的重要產(chǎn)區(qū)之一，因此，篩選新的用于防治馬鈴薯晚疫病的藥物，尤其是具有抗菌作用的生防菌迫在眉睫。

內(nèi)生細(xì)菌（endophyte）是指生活史某一階段或全部階段生活于健康植物組織或器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的一類細(xì)菌[8]。內(nèi)生細(xì)菌具有抑菌、誘導(dǎo)產(chǎn)生次生代謝物、固氮、溶磷及產(chǎn)吲哚乙酸等多方面的有益生物功能，增強(qiáng)宿主植物抗病蟲害能力及生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力等。由于內(nèi)生細(xì)菌作為生防因子具有巨大優(yōu)勢(shì)，因此利用內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治已成為研究的熱點(diǎn)之一。許多學(xué)者通過(guò)篩選拮抗菌或其代謝產(chǎn)物抑制致病疫霉[9]，或利用一些特定的活性物質(zhì)抑制致病疫霉[10]。 如申芬等報(bào)道拮抗菌發(fā)酵液能夠顯著抑制致病疫霉菌絲生長(zhǎng)，能使菌絲體發(fā)生畸變，降低孢子囊形成的能力，抑制孢子囊萌發(fā)、阻止休止孢萌發(fā)[11]。王梅菊等從油菜根莖部分離出來(lái)的1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） CanL-30，可以有效地防治灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和油菜黑脛病病菌（Leptosphaeeria biglobosa）等引起的病害，同時(shí)也可以促進(jìn)寄主油菜的生長(zhǎng)[12]。王玉琴等從高寒草地針茅葉部分離出的1株枯草芽孢桿菌（B. subtilis） 265ZY4對(duì)馬鈴薯壞疽病病菌（Phoma foveata）、馬鈴薯炭疽病病菌（Colletotrichum coccodes）和馬鈴薯枯萎病病菌（Fusarium avenaceum）具有明顯的拮抗作用，同時(shí)具有產(chǎn)吲哚-3-乙酸（IAA）和溶磷等能力[13]。崔月貞等從東祁連山高寒草地牧草分離出的3株內(nèi)生細(xì)菌[韋氏芽孢桿菌 （B. weihenstephanensis） 262AY11、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens） 262AY6和枯草芽孢桿菌（B.subtilis） 262AY2]對(duì)馬鈴薯晚疫病的抑菌率分別為78. 41%、78. 03%、75. 38%，且262AY11 和 262AY6 具有固氮和產(chǎn) IAA 的生物學(xué)功能[14]。

本研究從采集自祁連高寒草地矮火絨草根部樣品中分離篩選對(duì)馬鈴薯晚疫病有抑制效果的內(nèi)生細(xì)菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列鑒定，以期為生防菌劑的研發(fā)提供菌株資源，也為植物內(nèi)生細(xì)菌防治馬鈴薯晚疫病的生物防治開(kāi)發(fā)應(yīng)用等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病原菌 致病疫霉（P. infestans）菌株，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

大豆酪蛋白瓊脂（TSA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g/L，大豆蛋白胨 5 g/L，氯化鈉5 g/L，蒸餾水 1 000 mL，瓊脂20 g/L，pH值為7.3±0.2;理查德合成瓊脂（RSA）培養(yǎng)基：黑麥 60 g 催芽露白后使用，番茄汁 100 mL，CaCO3 0.4 g，瓊脂 18 g，蒸餾水1 000 mL;LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH值為7.2～7.4;LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂20 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.2～7.4。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌分離純化

按胥婷等的方法[15]分離矮火絨草根內(nèi)生細(xì)菌。用無(wú)菌水洗凈矮火絨草根部泥土后，濾紙吸干表面水分，稱取1.0 g根，于無(wú)菌室內(nèi)，用75%乙醇（1 min）、5%次氯酸鈉（5 min）、75%乙醇（30 s）依次對(duì)根表面進(jìn)行消毒，最后用無(wú)菌水洗滌4次，吸取最后1次洗滌的無(wú)菌水100 μL涂布TSA培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)2 d，無(wú)菌落長(zhǎng)出說(shuō)明表面消毒合格。表面消毒后，用無(wú)菌濾紙吸干根部表面的水分，再用無(wú)菌剪刀剪碎后置于無(wú)菌研缽中，加入少量滅菌的石英砂和9 mL無(wú)菌水充分研磨，得到10-1的菌懸液。梯度稀釋分別得到10-2、10-3、10-4濃度的菌懸液，各取100 μL菌懸液涂布于TSA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)，每個(gè)梯度做3次重復(fù)，培養(yǎng)2～7 d，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、透明度等特征挑取不同的細(xì)菌菌落分離純化，純化3～5代后，得到單菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)管并室溫保存。

1.3 生防內(nèi)生細(xì)菌篩選

1.3.1 平板拮抗活性測(cè)定

將分離獲得的細(xì)菌菌株接種到LB固態(tài)培養(yǎng)基上，37? ℃活化培養(yǎng)基24 h后，采用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選拮抗細(xì)菌。將細(xì)菌菌株轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基與經(jīng)RSA培養(yǎng)基活化的致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)，觀察菌株是否對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)有抑制效果，以十字交叉法測(cè)量抑菌帶，并計(jì)算抑菌率。以未接細(xì)菌菌株的RSA培養(yǎng)基為對(duì)照，選擇具有明顯抑菌帶的菌株，轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

抑菌率=對(duì)照菌落直徑-處菌菌落直徑對(duì)照菌落直徑×100%。

1.3.2 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液的抑菌活性測(cè)定

內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液的制備：將離體對(duì)致病疫霉的抑菌率大于70%的菌株經(jīng)LB固體培養(yǎng)基斜面活化后，接1環(huán)于盛50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h制成種子液，再按5%的接種量轉(zhuǎn)接至 50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)24 h得到菌液原液。將上述培養(yǎng)得到的菌液經(jīng) 12 000 r/min離心10 min，并經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器（22 μm）除菌后得到發(fā)酵濾液。

內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的影響：采用打孔法測(cè)試菌株無(wú)菌代謝液的抑菌作用，取200 μL的發(fā)酵濾液加入孔中（直徑為10 mm），以滅菌的空白LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。抑菌率統(tǒng)計(jì)方法同“1.3.1”節(jié)。

內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液對(duì)致病疫霉孢子囊萌發(fā)的抑制作用：參照張鉉哲等的方法[16]，將馬鈴薯晚疫病病菌制成孢子囊懸浮液，濃度調(diào)至在10×10倍顯微鏡下每個(gè)視野150～200個(gè)孢子囊，將孢子囊懸浮液與發(fā)酵濾液按1 ∶1的體積比混勻，每個(gè)處理吸取 15? μL 液體滴于干凈凹玻片上，于23 ℃培養(yǎng)24 h，觀察孢子囊萌發(fā)情況，芽管長(zhǎng)于孢子囊直徑視為萌發(fā)。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)以視野中所見(jiàn)到的孢子囊數(shù)為準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)抑制率。

1.4 溫室盆栽防效測(cè)定

試驗(yàn)于2019年在青海省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)所溫室中進(jìn)行。馬鈴薯下寨65品種放在陰暗潮濕處催芽，將芽眼帶薯塊切下，每盆3塊，每個(gè)處理種植10盆馬鈴薯植株，待其長(zhǎng)至10～12片葉時(shí)，分別噴施內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液和嘧菌酯，以清水為對(duì)照（CK），每株馬鈴薯植株噴施15 mL，2? d后進(jìn)行晚疫病病原菌接種。接種方法參照徐生軍等的方法[17]，用無(wú)菌水將晚疫病病菌培養(yǎng)平板上的游動(dòng)孢子囊洗下，經(jīng)滅菌紗布過(guò)濾后制成孢子囊懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板將孢子囊數(shù)調(diào)為1×105個(gè)/mL，置于4 ℃冰箱中2～3 h后取出，采用噴霧法接種。接種后 7 d 調(diào)查病害情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。盆栽試驗(yàn)以葉片為單位進(jìn)行調(diào)查，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按方中達(dá)的方法[18]。0級(jí)：葉片無(wú)病斑;1級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的比例<5%;3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的6%～10%;5 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的11%～20%;7級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的21%～50%;9 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉片面積的比例>50%。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)數(shù)值×100。

1.5 田間晚疫病防效測(cè)定

2019年田間試驗(yàn)設(shè)置在青海省農(nóng)林科學(xué)院馬鈴薯試驗(yàn)田。采用液體發(fā)酵法制備內(nèi)生菌株發(fā)酵液，過(guò)濾獲得發(fā)酵濾液。試驗(yàn)小區(qū)面積為40 m2，共設(shè)置8個(gè)處理，處理1～6分別為KBL6、KBL8、KBL17、KBL18、KBL19、KBL20發(fā)酵濾液83 L/666.7 m2;處理7為250 g/L嘧菌酯懸浮劑25 g/666.7 m2;處理8為清水對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列。田間出現(xiàn)中心病株時(shí)進(jìn)行病情指數(shù)的基數(shù)調(diào)查并施藥，之后每隔 7 d 施藥1次，共施藥3次，每次施藥前進(jìn)行病情指數(shù)的調(diào)查，并于施藥后 7 d再次進(jìn)行調(diào)查。每個(gè)小區(qū)分別進(jìn)行5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)選10株，計(jì)算病情指數(shù)及發(fā)病率，統(tǒng)計(jì)分析確定防治效果。田間試驗(yàn)以整株為單位進(jìn)行調(diào)查，病情分級(jí)參照方樹民等的方法[19]。0級(jí)：葉片無(wú)任何癥狀;1級(jí)：葉片上有個(gè)別病斑;2級(jí)：1/3 以下葉片有病斑;3級(jí)：1/3～1/2 葉片上有病斑;4級(jí)：1/2 以上葉片上有病斑;5 級(jí)：幾乎整株枯死。

病情指數(shù)=∑（病情級(jí)別×各級(jí)病株數(shù)）調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)數(shù)值×100。

防治效果=1-CK0×PT1CK1×PT0×100%。

式中：CK0表示對(duì)照組的藥前病情指數(shù);CK1表示對(duì)照組的藥后病情指數(shù);PT0表示藥劑處理組的藥前病情指數(shù);PT1表示藥劑處理組的藥后病情指數(shù)。采用DPS 7.05軟件，應(yīng)用Duncans新復(fù)極差法，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

1.6 菌株KBL17鑒定

本試驗(yàn)采用分子生物學(xué)鑒定菌株KBL17。使用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式試劑盒提取內(nèi)生細(xì)菌基因組，方法參照試劑盒說(shuō)明書。利用1對(duì)通用引物（27f和1492r）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板（50 ng/L）1.0 μL，上、下引物各1.0 μL，雙蒸水10.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增片段用生工生物工程（上海）股份有限公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化后，與pMD19-T載體16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落 PCR 驗(yàn)證正確后，提取質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成堿基序列測(cè)定。將測(cè)序獲得的16S rRNA通過(guò)與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast分析并利用 Clustal X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定KBL17的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 矮火絨草根內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果及其抑制作用

采集矮火絨草根組織，采用平板稀釋法，共分離獲得54株內(nèi)生細(xì)菌，編號(hào)分別為KBL1～KBL54，大部分菌株在LB培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)，大多菌落表現(xiàn)為濕潤(rùn)狀、乳白色、不規(guī)則、扁平、光滑，少數(shù)菌落邊緣褶皺、微黃色。將分離獲得的20株內(nèi)生細(xì)菌分別于經(jīng)RSA活化培養(yǎng)的致病疫霉菌株在RSA平板上對(duì)峙培養(yǎng)。由表1可知，能夠抑制致病疫霉生長(zhǎng)的菌株共有20株。其中，抑菌率達(dá)到80%以上的有6株（KBL6、KBL8、KBL17、KBL18、KBL19、KBL20菌株），以KBL17菌株的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)到95.47%。在表現(xiàn)抑菌作用較強(qiáng)的菌株中，KBL6和KBL8菌株與致病疫霉之間形成的抑菌帶不明顯，而KBL18（抑菌率為84.23%）和KBL20（抑菌率為81.04%）菌株形成的抑菌帶十分明顯。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液的抑菌活性測(cè)定

2.2.1 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的影響

將抑菌率達(dá)到80%以上的6個(gè)菌株分別擴(kuò)大培養(yǎng)后離心過(guò)濾得到其發(fā)酵濾液。由圖1可知，供試6個(gè)菌株的發(fā)酵濾液對(duì)致病疫霉菌絲的抑制率均在80%以上，較菌株對(duì)峙培養(yǎng)抑菌率有所下降，分別為83.21%、80.23%、92.58%、82.36%、81.37%、80.53%。其中，KBL8菌株降幅最大，為9.21百分點(diǎn)，其次為KBL19菌株，降幅為5.81百分點(diǎn)。其他菌株對(duì)峙與發(fā)酵濾液之間幅差在5%以內(nèi)，相對(duì)較穩(wěn)定。綜合評(píng)價(jià)KBL17菌株的抑菌率最高（92.58%），其次是KBL6菌株（83.21%），KBL8菌株的抑菌率最低，為80.23%。

經(jīng)對(duì)峙平板觀察發(fā)現(xiàn)，受6個(gè)菌株發(fā)酵濾液抑制的致病疫霉菌落變小，菌絲致密，生長(zhǎng)速率降低。顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵濾液導(dǎo)致致病疫霉菌絲畸變，菌絲無(wú)法正常伸展，菌絲尖端呈現(xiàn)球形的畸變。

2.2.2 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液對(duì)致病疫霉孢子囊萌發(fā)的抑制作用

將6株內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液和致病疫霉的孢子囊懸浮液混合后發(fā)現(xiàn)，無(wú)菌發(fā)酵濾液均可強(qiáng)烈抑制致病疫霉孢子囊的萌發(fā)，抑制率達(dá)到82.49%～96.03%（圖1），顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵濾液引起致病疫霉孢子囊形態(tài)發(fā)生畸變，多為外壁破裂、中空結(jié)構(gòu)、內(nèi)含物分隔于兩極、空孢子囊類型。

2.3 溫室盆栽防效測(cè)定

由表2可知，致病疫霉游動(dòng)孢子接種 5 d 后，清水對(duì)照組病情指數(shù)達(dá)到86.17，而生防菌KBL6、KBL8、KBL17、KBL18、KBL19、KBL20處理組馬鈴薯晚疫病病情指數(shù)顯著降低，防治效果分別達(dá)到了70.56%、66.91%、76.04%、71.15%、68.85%、65.79%。陽(yáng)性對(duì)照嘧菌酯的病情指數(shù)僅為15.02，防治效果達(dá)到82.57%。各處理組的病情指數(shù)與對(duì)照相比達(dá)到顯著性差異，嘧菌酯處理與各個(gè)內(nèi)生菌處理組的防效達(dá)到顯著性差異，顯著高于內(nèi)生菌株處理組。

2.4 田間防效測(cè)定

由表3可知，連續(xù)噴施3次生防菌劑，處理7（化學(xué)藥劑）對(duì)馬鈴薯晚疫病的防治效果最好，平均防效可達(dá)70.27%，其次為處理3（KBL17菌株），平均防效達(dá)67.45%，防效最差的為處理2（KBL8菌株），平均防效僅為54.81%。

2.5 內(nèi)生菌株的鑒定

用引物27f/1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得約 1 444 bp 的片段。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他細(xì)菌16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析其分類地位。發(fā)現(xiàn)該菌的16S rDNA與假單胞菌序列有很高的同源性。構(gòu)建16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)KBL17菌株與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）聚在一個(gè)群組里（圖2），初步確定KBL17為熒光假單胞菌（P. fluorescens）。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生細(xì)菌分布于宿主植物的不同部位，由于其生存環(huán)境相對(duì)封閉，因此其生長(zhǎng)發(fā)育不易受外界不良環(huán)境的干擾，這一生境優(yōu)勢(shì)使其在植物病害防治中擁有比根圍、葉圍細(xì)菌更大的應(yīng)用空間[20]。利用內(nèi)生細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物抑制植物病害已有許多研究，目前用于防治植物病害的內(nèi)生細(xì)菌種類主要以芽孢桿菌屬和假單胞桿菌屬為主[21]。有文獻(xiàn)報(bào)道，熒光假單胞桿菌的一些菌株已在食品[22]和環(huán)境保護(hù)[23]等領(lǐng)域展現(xiàn)出很大潛力，在馬鈴薯晚疫病防治方面，Bengtsson等研究發(fā)現(xiàn)1株熒光假單胞桿菌（P. koreensis 2.74）產(chǎn)生的表面活性劑既能使馬鈴薯致病疫霉的游動(dòng)孢子裂解，也能誘導(dǎo)馬鈴薯對(duì)致病疫霉產(chǎn)生抗性[24]。Zegeye等對(duì)熒光假單胞桿菌（P. koreensis）Bak150菌株對(duì)致病疫霉具有強(qiáng)烈的抑制作用，抑制率可達(dá)88%以上[25]。本試驗(yàn)從矮火絨草根中分離篩選致病疫霉拮抗細(xì)菌，54株細(xì)菌中有20株有一定的抑菌作用，其中活體菌株KBL17和KBL8的抑菌率最高，分別為95.47%、88.37%，而無(wú)菌代謝液以KBL17和KBL6菌株的抑菌率最高，分別為92.58%、83.21%。綜合菌株和無(wú)菌代謝液的抑菌率，以KBL17菌株的抑菌作用最為穩(wěn)定，抑菌率均在90%以上。經(jīng)初步鑒定，對(duì)致病疫霉抑制能力較強(qiáng)的菌株KBL17為熒光假單胞桿菌，這與蔣繼志等報(bào)道的結(jié)果[26]相一致。

目前，很多在平板上對(duì)致病疫霉有拮抗作用的菌株，當(dāng)用于盆栽或田間防治時(shí)，防治效果減弱或無(wú)防治效果。Caulier等施用假單胞菌P. protegens 44R-P8 和P. brenneri 43R-P1的菌懸液，對(duì)馬鈴薯晚疫病的防治效果分別為83%、64%[27]。李雙東等施用枯草芽孢桿菌EB-2的菌懸液和無(wú)菌體發(fā)酵液，對(duì)馬鈴薯晚疫病的防治效果分別為61.80%、60.54%[28]。胡軍華等將假單胞菌20-5的發(fā)酵液先噴于馬鈴薯葉片上再接種馬鈴薯晚疫病菌，馬鈴薯苗不發(fā)病或發(fā)病很輕。在本研究盆栽試驗(yàn)中，6個(gè)菌株處理與對(duì)照相比，馬鈴薯晚疫病病情指數(shù)均有不同程度的下降，說(shuō)明6個(gè)菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病有很好的抑菌活性，其中以菌株KBL17的防效最高，為76.04%，略低于化學(xué)農(nóng)藥嘧菌酯的防效（82.57%）[29]。田間試驗(yàn)中，菌株KBL17的平均防效為67.45%，嘧菌酯的平均防效為70.27%。說(shuō)明該菌株在馬鈴薯晚疫病的生物防治中具有應(yīng)用潛力。

綜上，噴施內(nèi)生細(xì)菌有助于馬鈴薯抵抗晚疫病病菌的侵染，提高馬鈴薯的抗病能力，在田間試驗(yàn)中也具有良好的防治效果，未來(lái)可通過(guò)內(nèi)生細(xì)菌與化學(xué)殺菌劑聯(lián)合使用，以減少晚疫病病菌的侵染，達(dá)到防病增收的效果。關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌在大田生產(chǎn)中的應(yīng)用，仍需大量試驗(yàn)，其作用機(jī)制也需更深入的研究。

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