公路沿線不同植物葉際微生物群落結構及重金屬污染比較

周之棟 徐建華

摘要：公路沿線由于汽車尾氣和揚塵導致重金屬污染嚴重，道路綠化應兼顧植被對重金屬污染物的凈化作用。選擇公路兩側4種樹種為研究對象，即海濱木槿（Hibiscus hamabo）、金邊胡禿子（Elaeagnus pungens）、山核桃（Carya cathayensis）和中山杉（Taxodium ‘Zhongshansha ）118，測定其葉際微生物群落結構組成和葉際重金屬、根際土壤重金屬含量。結果顯示，不同植物葉際微生物群落結構和物種組成顯著不同;中山杉和海濱木槿具有更高的葉際微生物多樣性（PD_whole_tree、Shannon、Simpson），而中山杉葉際微生物的豐富度（OTUs、Chao1）最高;中山杉和金邊胡禿子葉片Cr（鉻）、Cu（銅）、Zn（鋅）、Cd（鎘）和Pb（鉛）含量較低，而對于植被林下土壤重金屬含量，海濱木槿較低，中山杉顯著高于其余樹種;葉片Cr、Cu、Zn以及重金屬總量對葉際微生物群落結構具有顯著性影響（P<0.05）。綜合以上結果，不同植物對不同重金屬元素的凈化能力不同，其中中山杉總體上對公路交通揚塵阻隔和凈化效果更好。

關鍵詞：公路;重金屬;汽車尾氣;葉際;微生物

中圖分類號：X173?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）18-0215-07

收稿日期：2020-12-12

基金項目：江蘇省中科院植物研究所博士人才科研啟動基金（編號：JSPKLB202027）。

作者簡介：周之棟（1990—），男，江蘇南京人，博士，助理研究員，主要從事微生物生態(tài)學研究。E-mail：1289597338@qq.com。

公路交通中汽車汽油、柴油的燃燒尾氣，輪胎、剎車片的磨損，道路路面瀝青磨損等是公路沿線重金屬污染的主要來源[1-2]。這些污染物主要以汽車揚塵的形式進入公路沿線兩側空氣和土壤中，其次通過自然沉降、降雨沉降等形式遷移進入路域土壤-植物系統(tǒng)中，給周圍農田、居民造成污染[3]。以往關于公路沿線重金屬污染的研究主要集中在重金屬在路域范圍的空間分布格局、植物對汽車揚塵的滯沉效果的研究[4-5]。研究表明，植物對公路交通引起的重金屬污染具有很好的阻隔、凈化效果，其凈化效應主要表現(xiàn)為植物葉片對重金屬的吸收、吸附，植物地上部分的直接物理阻擋作用，根系對路域土壤重金屬污染物的吸收等形式[6-7]。葉際微生物作為葉片表面參與植物生理生化活動的活躍成分，對植物生理特性具有顯著影響，且對環(huán)境變化敏感[8]，而路域環(huán)境下不同植物葉際微生物的群落組成異同以及對植物葉片吸收富集重金屬元素影響的研究鮮有涉及。

葉際微生物已被證明與植物葉際微環(huán)境變化、促植物生長物質的產生、葉際環(huán)境污染物的降解等有密切關系[9]。環(huán)境條件的改變會影響葉際微生物的群落結構組成，影響植物形態(tài)、生長和生理生態(tài)過程，進而影響植物對重金屬污染物的吸收富集。葉際微生物可通過吸附、氧化還原重金屬以及礦化固結重金屬離子來輔助植物葉片對交通粉塵的凈化[10]。因此，本研究通過比較公路沿線不同植物葉際微生物群落結構組成、葉片重金屬含量和土壤重金屬含量，并結合生物統(tǒng)計分析，以期揭示不同植物對公路交通揚塵重金屬污染的凈化規(guī)律及效果。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品于2020年9月采集。采樣地點位于江蘇省省道S334公路兩側（南通市如皋市搬經鎮(zhèn)段，120°23′43″E，32°17′40″N）。選取公路兩側4種主要綠化樹種為研究對象，即海濱木槿、金邊胡禿子、山核桃和中山杉118（以下文中稱為中山杉）。均勻采集植物各部位葉片（約100張），混合作為1個樣品，每種樹采集3個重復。采集每種植被林下0～20 cm土層土壤，圍繞植株取3個點，混合作為1個土壤樣品，每種樹采集3個重復。將采集的部分葉片樣品（用于葉際微生物群落結構測定）置于冰盒中，迅速帶回實驗室進行后續(xù)分析。

1.2 葉片和土壤重金屬含量測定

葉片樣品置于105 ℃烘箱中殺青2 h，之后 85 ℃ 烘干至恒質量。烘干后的葉片樣品研磨粉碎。土壤樣品進行風干處理，并研磨過0.149 mm篩。樣品處理過程中避免接觸金屬制品，以避免對重金屬測定的影響。樣品消解采用微波消解儀（JUPITER，SINEO）。重金屬Cr、Cu、Zn、Cd和Pb含量的測定采用電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS，ThermoFisher，USA）。

1.3 葉際微生物測定

取新鮮葉片20 g置于裝有100 mL滅菌水的三角瓶中，超聲波（40 kHz）振蕩處理10 min。轉移浸提液于離心管中，離心（11 000 r/min，4 ℃）獲取沉淀物用于后續(xù)葉際微生物DNA提取。采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit （Omega Bio-tek，Norcross，Georgia，USA）試劑盒提取沉淀物中微生物總的DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳和Qubit 3.0 熒光計（Life Technologies，USA）進行DNA質量檢測和定量。針對16S rRNA的V4-V5區(qū)域進行PCR（聚合酶鏈式反應）擴增。所用引物為515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）。擴增程序設定為：95 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環(huán);最終 72 ℃ 延伸5 min。PCR 20 μL反應體系包括：4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶和10 ng模板DNA。擴增子采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行提取，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 試劑盒進行純化（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA），并用Qubit 3.0 熒光計進行定量。測序文庫按照標準流程在Illumina HiSeq平臺進行雙末端測序（2×250）（南京集思慧遠生物科技有限公司）。

原始fastq格式測序文件經過QIIME軟件（version 1.17）進行多路分解和質量過濾處理。序列處理遵循以下標準：（1）250 bp序列在10 bp 滑窗中的平均質量得分小于20的任意堿基位點處被截斷;（2）條碼序列的任何錯配，引物序列的2個核苷酸的錯配以及模糊的序列被剔除;（3）大于10 bp重疊的條帶進行組裝。采用UPARSE（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/）依據(jù)97%的相似性閾值進行OTU（operational units）劃分，采用UCHIME進行嵌合體序列的識別和去除。利用uclust程序對比于silva數(shù)據(jù)庫對16S rRNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育關系歸類，置信閾值控制在50%。

1.4 統(tǒng)計分析

物種數(shù)量稀釋性曲線采用Mothur軟件分析。葉際微生物多樣性指數(shù)Chao1、PD_whole_tree、Shannon、Simpson采用R語言（vegan包）軟件進行計算。Venn圖、柱狀圖、熱圖、聚類分析、主坐標分析（基于weighted unifrac距離）、冗余分析采用R語言繪制（vegan包和ggplot2包）。采用Adonis算法對比不同樣本間葉際微生物群落結構的差異。采用單因素方差分析結合Duncans多重分析比較不同樣本間重金屬含量的統(tǒng)計學差異。LEfSe分析采用網頁分析器http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy，以LDA=3判別分值作為劃分各樣本特有生物標記物（biomarker）的閾值。

2 結果與分析

2.1 不同植物葉際微生物群落結構組成

微生物種類數(shù)量稀釋性曲線隨測序深度增加趨于平緩，測序深度達到0.99，表明本試驗測序量足夠支持后續(xù)分析（圖1）。中山杉和海濱木槿葉際微生物多樣性較高，各多樣性指數(shù)較之于其他樹種分別高出98.15%～352.85%（PD_whole_tree）、19.93%～250.00%（Shannon）、116.67%～173.33%（Simpson）;其中中山杉具有最大的物種豐富度指數(shù)，OTUs指數(shù)高于其他樹種102.33%～438.14%、Chao1指數(shù)高出70.45%～296.53%（表1）。不同樹種間葉際微生物物種組成差異較大，其中中山杉具有最多的特有微生物種類（557個OTU），其次為海濱木槿（38個OTU）（圖2）。

在微生物門水平上，不同樹種變形菌門（Proteobacteria）占比最大（52.02%～99.50%）。在門水平上，山核桃具有較豐富的Proteobacteria，海濱木槿具有較豐富的藍藻門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），金邊胡禿子具有較豐富的厚壁菌門（Firmicutes），中山杉具有較豐富的擬桿菌門（Bacteroidetes）、Actinobacteria、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、疣微菌門（Verrucomicrobia）（圖3-a）。在屬水平上，山核桃具有較豐富的泛菌屬（Pantoea）、乳球菌屬（Lactococcus），海濱木槿具有較豐富的馬賽菌屬（Massilia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、短小桿菌屬（Curtobacterium），金邊胡禿子具有較豐富的狹義梭菌屬1（Clostridium sensu stricto 1）、Kosakonia、芽孢桿菌屬（Bacillus）、狹義梭菌屬5（Clostridium sensu stricto 5），中山杉具有較豐富的Sphingomonas、Curvibacter、Hafnia-Obesumbacterium、Methylobacterium（圖3-b）。不同植物葉際微生物群落結構組成具有顯著差異（P<0.05）（圖3-c）。

LEfSe分析顯示不同植物的葉際微生物具有各自特有的生物標記物，即特有的豐富物種（圖4）。中山杉和海濱木槿具有最多的生物標記物，分別為39和32個。山核桃生物標記物為Proteobacteria，海濱木槿生物標記物主要為Actinobacteria、Oxyphotobacteria、Micrococcales、Chloroplast、Acetobacterales、Caulobacterales、立克次氏體目（Rickettsiales）、假單胞菌目（Pseudomonadales）、Xanthomonadales，金邊胡禿子生物標記物為Clostridia、Clostridiales、Clostridiaceae 1、芽孢桿菌目（Bacillales）、芽孢桿菌科（Bacillaceae），中山杉生物標記物主要是Actinobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、擬桿菌綱（Bacteroidia）、Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Planctomycetacia、Propionibacteriales、Micromonosporales、Kineosporiales、Corynebacteriales、Cytophagales、Sphingomonadales、紅細菌目（Rhodobacterales）、Rhizobiales、Myxococcales。

2.2 葉片和土壤重金屬含量

不同植物葉片重金屬含量存在顯著差異（圖5）。海濱木槿葉片對Cr、Cu、Pb的富集能力較強;山核桃對Zn、Cd、Pb的富集較多，中山杉和金邊胡禿子對幾種重金屬的葉片富集能力較弱。對于幾種重金屬的整體富集能力，海濱木槿和山核桃表現(xiàn)更好。

不同植物林下土壤重金屬含量表現(xiàn)出顯著性差異（圖6）。中山杉林下土壤重金屬含量較高，顯著高于其他樹種。海濱木槿林下土壤重金屬含量最低。山核桃和金邊胡禿子林下土壤重金屬含量無顯著性差異。

對土壤和植物葉片重金屬濃度進行比值計算，除Pb之外，其余重金屬濃度比值集中在0.76～4.69（表2）。海濱木槿和山核桃比值較低，中山杉和金邊胡禿子比值較高。通過比值計算，說明植物通過葉片截留和沉降是公路沿線兩側樹木對汽車尾氣揚塵污染阻隔的主要途徑。

2.3 重金屬含量與微生物群落結構組成的相關性分析

冗余分析模型（RDA）前2個坐標軸解釋了63.63%（葉片重金屬）和74.74%（土壤重金屬）的變異量，說明該模型可以很好地解釋微生物群落結構與重金屬含量之間的相關關系。在OTU水平上的冗余分析表明，葉片重金屬Cr、Cu、Zn、Sum對葉際微生物群落結構具有顯著性影響（圖7，表3）。土壤重金屬含量與葉際微生物群落結構的相關性較弱。RDA模型將不同植物的葉際微生物群落顯著區(qū)分開。分析重金屬含量與RDA坐標軸的相關性，葉片重金屬Cu和Pb含量與Cr、Cd、Zn和Sum含量之間呈現(xiàn)負相關性;土壤重金屬含量之間呈現(xiàn)正相關性。RDA模型中OTU1、OTU2、OTU3、OTU7、OTU9、OTU55（Proteobacteria），OTU4（Cyanobacteria），OTU5、OTU6、OTU8、OTU11（Firmicutes）與葉際微生物群落結構和重金屬含量具有較強的相關性。

3 討論與結論

由物種數(shù)量稀釋性曲線結合測序深度（Coverage）可知測序條帶數(shù)量已經充分覆蓋葉際微生物種類。稀釋性曲線結果與Chao1豐富度指數(shù)一致，即中山杉具有較高的物種豐富度，而山核桃最少，這說明中山杉作為針葉喬木樹種，相比于其他闊葉喬木及灌木，其葉際具有更為復雜的微生物群落結構組成。中山杉葉際相較于其余樹種具有極為豐富的特有微生物物種組成，如venn圖分析顯示其具有557種特有OTU，LEfSe分析其特有生物標記物為39種，這些指標均遠高于其余樹種。分析可能的原因是中山杉葉片特有的分泌物或葉面結構[11]，提供給環(huán)境中微生物適宜的生存場所，從而招募更多樣化的微生物類群寄居在其葉片表面，這有待于后續(xù)更深入探索其中的機理。根據(jù)微生物對重金屬凈化機理的研究，本研究分析中山杉葉際多樣化的微生物種類對公路揚塵中的重金屬元素進行初步的生化反應轉化，一部分重金屬元素固持在微生物體內，一部分重金屬元素活化后可增加葉片對其的吸收積累[12-14]。葉際微生物與植物葉片重金屬的吸附作用的顯著關系通過冗余分析結果也得以體現(xiàn)，這進一步說明葉際微生物在參與植物凈化路域重金屬污染中的作用。微生物類群Proteobacteria作為不同樹種葉際微生物的優(yōu)勢菌群，反映出其對環(huán)境的較廣的適應能力[9，15]，本研究中RDA模型同樣發(fā)現(xiàn)葉片和土壤重金屬元素含量與該微生物類群的顯著相關關系，說明該微生物種群在葉際微環(huán)境中發(fā)揮了重要作用。在微生物屬水平上的優(yōu)勢類群Pantoea、Massilia、Pseudomonas也隸屬于該菌類。

公路交通帶來的汽車尾氣、部件摩擦等產生的攜帶重金屬顆粒的揚塵是引起沿線路域重金屬污染的主要來源。揚塵經過自然沉降或降雨等形式沉降到植物葉片表面和林下土壤中，因此作為直接暴露在此大氣揚塵污染環(huán)境中的植物葉片，其直接對重金屬的吸附是凈化重金屬的重要途徑[16-18]。植物從土壤中吸收重金屬主要集中于根部，而短時間內從土壤到葉片的富集量較少，因此路域植物的葉片直接吸附吸收重金屬是一條重要途徑[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，路域葉片重金屬濃度與土壤重金屬含量比值集中在0.76～4.69（Pb除外，這說明植物對Pb吸附凈化能力較之其余元素弱），這進一步說明由大氣環(huán)境中揚塵帶來的重金屬污染通過葉片的吸附、吸收。本研究還發(fā)現(xiàn)，中山杉葉片中重金屬含量相比于其他樹種濃度含量較低，可能解釋是多樣性的中山杉葉際微生物通過吸收固定重金屬粉塵阻隔了進一步進入中山杉葉片內部。通過RDA模型發(fā)現(xiàn)，葉片重金屬含量（Cr、Cu、Zn和Sum）與葉際微生物群落結構具有顯著相關關系。本研究未考慮以濃度進行比較的局限性。之前研究也從葉片的組織結構、分泌物以及葉型等角度探討葉面對空氣中粉塵污染物附著以及吸收的影響[21-22]，但也有研究討論了降雨以及風力作用可以比較容易移走大部分聚集在葉面的附著粉塵從而使其最終沉降到林下土壤[16]。因此，考量公路綠化植被下土壤中重金屬元素的含量，可以從一個側面反映植物對揚塵的阻隔作用。中山杉林下土壤重金屬含量較高，說明其較強的揚塵阻隔能力，將交通揚塵阻隔于林下土壤中，阻止其進一步向公路兩側農田和居住區(qū)的擴散。這可能與中山杉樹形有關：其植株呈寶塔形，主干下部萌生較多枝條，加之葉型為針葉且茂密，可以很好地遮擋交通揚塵。作為灌木的海濱木槿和金邊胡禿子可能由于樹形低矮，而山核桃枝葉稀疏，致使它們對揚塵的阻隔效應并不明顯。

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