快速排查液質(zhì)聯(lián)用儀靈敏度低和污染問題研究

王德利，鄒志永，楊昊，姜俊，胡文紅

（1.山東省食品藥品檢驗研究院；2.山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101）

液質(zhì)聯(lián)用儀因其高通量、高靈敏度和高選擇性，已被廣泛應(yīng)用于食品藥品安全檢測、環(huán)境檢測和血液濃度檢測等多種實驗。在日常使用中，靈敏度降低和污染問題是兩個常見的故障，在故障排查的過程中，應(yīng)分別從液相色譜和質(zhì)譜兩個模塊入手，由簡入繁逐步排查。筆者將以Waters公司的Xevo TQ-S IClass系統(tǒng)為例，介紹液質(zhì)聯(lián)用儀以上兩種故障的排查。

1 靈敏度降低問題

當(dāng)遇到進(jìn)樣時出現(xiàn)靈敏度降低，甚至是不出峰的問題時，如果系統(tǒng)配置內(nèi)有TUV等紫外檢測器，可通過對比紫外色譜圖數(shù)據(jù)是否正常，快速排查問題是否發(fā)生在液相側(cè)或者質(zhì)譜側(cè)。

1.1 排查液相側(cè)問題

（1）確認(rèn)樣品的前處理是否正確。例如，溶解樣本的溶劑是否發(fā)生變化，導(dǎo)致樣品沒有被溶解。

（2）檢查流動相。①流動相是否添加了適合的添加劑（例如：甲酸和氨水）,這將影響目標(biāo)化合物的離子化效率。②流動相是否是新鮮配置的（有機(jī)試劑要求使用色譜純級別以上（推薦進(jìn)口品牌），水相溶液要用超純水（18.2MΩ）當(dāng)天制備。使用時間過長的流動相內(nèi)的添加劑揮發(fā)或者長菌，會導(dǎo)致目標(biāo)物的電離效果變差。③流動相內(nèi)不可添加不揮發(fā)性的鹽，無機(jī)酸等。④流動相儲液瓶不可使用表面活性劑等清洗。

（3）確認(rèn)進(jìn)樣器的吸樣量是否正確。①樣品注射器滲漏或者有氣泡會導(dǎo)致吸樣量過低或者無法正常吸取樣品。例如，在Waters 進(jìn)樣器的控制面板內(nèi)可運行樣品注射器的滲漏測試，若測試無法通過，則可能為注射器滲漏或者有氣泡；在執(zhí)行進(jìn)樣器灌注后，再次執(zhí)行注射器滲漏測試，若依舊無法通過，則可能為注射器磨損，需更換。②注意進(jìn)樣小瓶瓶蓋不可擰得過緊或者樣品液面高度過低，否則，會導(dǎo)致吸樣量不準(zhǔn)確。

（4）目標(biāo)化合物無法被洗脫。例如，色譜柱故障或者液相梯度方法無法滿足目標(biāo)化合物洗脫要求等，導(dǎo)致目標(biāo)物無法被正常洗脫引起的不出峰。

（5）系統(tǒng)管路漏液。系統(tǒng)管路漏液導(dǎo)致目標(biāo)化合物無法到達(dá)質(zhì)譜檢測器，檢查系統(tǒng)管路各個接頭是否漏液。

1.2 排查質(zhì)譜側(cè)問題

（1）檢查毛細(xì)管噴霧。正常的噴霧形狀，應(yīng)當(dāng)是連續(xù)、對稱的扇形霧狀區(qū)域。噴霧不正常，則意味著目標(biāo)化合物無法被充分電離，從而導(dǎo)致靈敏度降低。若無噴霧或噴霧不對稱，可能是由于系統(tǒng)管路存在漏液處，導(dǎo)致液體無法到達(dá)毛細(xì)管或者毛細(xì)管堵塞，此時，需要檢查管路是否存在漏液情況以及必要時更換毛細(xì)管。

（2）隔離閥關(guān)閉。在Waters Xevo TQ-S型質(zhì)譜的離子源上，設(shè)有一個隔離閥，目的是在清洗錐孔時，將其關(guān)閉，確?？諝獠粫M(jìn)入儀器內(nèi)部導(dǎo)致卸真空。若隔離閥關(guān)閉，則母例子無法進(jìn)入質(zhì)譜內(nèi)部，導(dǎo)致無法檢測到信號。

（3）質(zhì)譜的流路切換閥位于廢液位置。在Waters Xevo TQ-S型質(zhì)譜上設(shè)有一個流路切換閥，可以選擇是否讓流動相及樣品進(jìn)入毛細(xì)管。若流路切換閥的位置設(shè)定在廢液位置，導(dǎo)致樣品全部流入廢液，從而無法檢測到信號。

流路切換閥的設(shè)定如圖1、圖2所示。

圖1 Xevo TQ-S流路閥的切換

圖2 Xevo TQ-S流路閥的設(shè)定

（4）附著離子/附著質(zhì)子。例如，目標(biāo)化合物本應(yīng)被電離成[M+H]+，但是，由于系統(tǒng)內(nèi)被引入了Na+，導(dǎo)致電離生成[M+Na]+，抑制了[M+H]+電離生成。

（5）方法文件是否調(diào)用正確或反饋是否正常。①在軟件內(nèi)檢查調(diào)用的方法文件是否正確。例如，以Waters Masslynx軟件為例，需要檢查調(diào)諧文件（及其對應(yīng)的校正文件），液相方法和質(zhì)譜方法是否調(diào)用正確，進(jìn)樣體積是否設(shè)定正確。②質(zhì)譜的反饋參數(shù)是否正常。檢查質(zhì)譜的毛細(xì)管電壓，錐孔電壓等反饋是否正常，這些電壓決定了離子化效率；同時，需要檢查質(zhì)譜檢測器的光電倍增管道電壓，它決定了信號的大小。

（6）質(zhì)譜的質(zhì)量軸和分辨率。使用儀器的調(diào)諧液和校正液，檢查儀器的質(zhì)量軸和分辨率是否正確。若發(fā)生偏移，需要重新調(diào)諧并校正質(zhì)譜。

（7）定期重新調(diào)諧樣品方法文件。隨著時間推移，質(zhì)譜的質(zhì)量軸會發(fā)生偏移，同時，目標(biāo)化合物所需的錐孔電壓參數(shù)也需要重新調(diào)諧。因此，需要重新配置目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)品調(diào)諧液，調(diào)諧目標(biāo)物的儀器方法參數(shù)。

（8）質(zhì)譜需要清洗維護(hù)。毛細(xì)管和離子源的污染會降低離子化效率和離子傳輸效率，并可按照質(zhì)譜操作維護(hù)手冊，更換毛細(xì)管組件，清洗質(zhì)譜的離子源和透鏡。

（9）實驗環(huán)境。確保實驗室的溫度和濕度符合要求。例如，若實驗室的溫度波動過大，容易導(dǎo)致質(zhì)量軸發(fā)生偏移。同時，會影響真空系統(tǒng)的工作效率，導(dǎo)致質(zhì)譜儀容易被污染，引起靈敏度降低。

2 污染問題

接下來，我們將討論污染問題。在日常實驗過程中，由于進(jìn)樣濃度過高、樣品前處理不當(dāng)?shù)?，會引起儀器的污染導(dǎo)致噪音過高或殘留峰。當(dāng)遇到上述問題時，可按照下述步驟逐步排查：

（1）使用干凈的試劑沖洗毛細(xì)管和質(zhì)譜蠕動泵，隨后使用質(zhì)譜的蠕動泵將流動相（例如，甲醇/水50:50）按0.3ml/min的流速注入質(zhì)譜內(nèi)。

（2）此時，如果污染水平有明顯的降低，則污染可能主要發(fā)生在液相中。

（3）如果污染水平?jīng)]有明顯降低，則污染可能主要發(fā)生在質(zhì)譜中。

2.1 排除液相側(cè)故障

（1）更換新的色譜柱。隨著色譜柱的使用時間增加或者進(jìn)樣濃度過高時，污染物在色譜柱上發(fā)生積聚或殘留，當(dāng)正常運行樣品時，污染物則會被從色譜柱上洗脫下來。通過對比新/舊色譜柱所出的色譜圖上的信號峰，可快速排查污染是否發(fā)生在色譜柱上。

（2）檢查流動相。將進(jìn)樣時所使用的流動相按照1:1的比例混合后，倒入進(jìn)樣小瓶中，通過質(zhì)譜的蠕動泵注入到質(zhì)譜中。此時，如果色譜圖上存在污染，則存在溶劑瓶或者流動相存在污染；如果色譜圖上無污染，則流動相是沒有問題的。需再通過液相進(jìn)樣的方式，將1:1混合液進(jìn)入質(zhì)譜，如果在色譜圖中觀察到污染物，則污染可能發(fā)生在進(jìn)樣器或者液相泵。此時，需要執(zhí)行下一步操作，以確定污染具體發(fā)生在哪個模塊。

（3）執(zhí)行零體積進(jìn)樣。將進(jìn)樣體積設(shè)定為0ul，然后執(zhí)行進(jìn)樣。此時，如果在色譜圖上發(fā)現(xiàn)污染，則污染發(fā)生在液相泵上；如果不存在污染，則污染發(fā)生在進(jìn)樣器上。

（4）檢查液相泵。將液相泵和進(jìn)樣器之間的連接管路從進(jìn)樣器上斷開，將管路直接連接到色譜柱上，再次進(jìn)樣。此時，如果色譜圖上存在污染，則污染發(fā)生在液相泵上；如果色譜圖上不存在污染，則污染發(fā)生在進(jìn)樣器上。

（5）檢查進(jìn)樣器。①檢查樣品。通過更改進(jìn)樣體積，例如，將進(jìn)樣體積改成2倍。如果污染水平隨著進(jìn)樣體積的增大而增大，則樣品有可能已經(jīng)被污染。此時，需進(jìn)一步確認(rèn)進(jìn)樣瓶、樣品稀釋劑和樣品。②檢查進(jìn)樣瓶。更換一個新的進(jìn)樣瓶測試，如果污染消失，則污染源存在于進(jìn)樣瓶中；如果污染仍存在，則需確認(rèn)稀釋劑和樣品。③檢查樣品稀釋劑。將樣品稀釋劑倒入新的進(jìn)樣瓶，作為樣品進(jìn)樣測試。如果污染存在，則污染源為樣品稀釋劑；如果污染消失，則污染源來于樣品前處理時的污染。④更改進(jìn)樣模式。針對Waters IClass Full Loop型自動進(jìn)樣器，可以切換3種進(jìn)樣方式。如果樣品體積變化未對污染水平高低產(chǎn)生影響，可將進(jìn)樣模式從PLNO模式切換到partial loop或full loop測試。如果污染仍然存在，檢查進(jìn)樣針清洗液。⑤檢查進(jìn)樣針清洗液。進(jìn)樣針清洗溶液需要根據(jù)樣品的極性高低等來配置。不正確的清洗液會導(dǎo)致樣品殘留在進(jìn)樣針上，從而導(dǎo)致污染。重新配置進(jìn)樣針清洗溶劑后，再次執(zhí)行進(jìn)樣，并檢查污染。如果污染仍然存在，需要檢查進(jìn)樣器上的管路和接頭。⑥檢查進(jìn)樣器上的管路和接頭。檢查連接至色譜柱入口管路，如果存在死體積，污染物可能會積聚在這些空間里；同時，色譜柱前接的保護(hù)柱或過濾器，如果長時間未更換，會積蓄過多的污染物，被洗脫下來，導(dǎo)致污染。更換管路、接頭和保護(hù)柱。再執(zhí)行一次進(jìn)樣，并檢查污染。如果仍存在，則需要更換針。⑦更換針。進(jìn)樣針通常有Peek和不銹鋼兩種材質(zhì)，一些疏水性化合物會易于吸附到peek針上，在運行此類樣品時，則需更換不銹鋼進(jìn)樣針。在更換進(jìn)樣針后，再執(zhí)行一次進(jìn)樣。如果污染仍然存在，更換進(jìn)樣器其他部件。⑧更換其他進(jìn)樣器部件。如果執(zhí)行完上述步驟后，依舊存在故障，則進(jìn)樣器上的其他部件依舊存在被污染的風(fēng)險，如進(jìn)樣閥，可以進(jìn)行更換測試。

2.2 排除質(zhì)譜側(cè)故障

如果排除液相色譜系統(tǒng)故障無法找出污染位置，則污染可能發(fā)生在質(zhì)譜上。

（1）檢查前端組件。最可能的MS污染位置是前端組件：ESI探頭（探頭尖、毛細(xì)管、雙通）、錐孔、離子源、源外殼、連接到API源的PEEK管路、質(zhì)譜上的流路選擇閥、氮氣管路、氮氣源（如氮氣發(fā)生器）。

（2）清洗或更換并測試各組件。拆下、清洗或更換測試以上各組件，在清洗時，需注意要確保清洗器皿和清洗溶劑的潔凈。質(zhì)譜部件在清洗后需要用高純氮氣吹干。

3 結(jié)語

液質(zhì)聯(lián)用儀是一個復(fù)雜的系統(tǒng)體系，因此，在故障排查過程中，要將系統(tǒng)中可能出現(xiàn)故障的點逐一排查，由簡入繁，做單一變量排查，更易于準(zhǔn)確找到故障點。最后強(qiáng)調(diào)一點，好的維護(hù)勝過好的維修，正確的樣品前處理、流動相的定期更換、液質(zhì)聯(lián)用儀的清洗維護(hù)和定期更換易耗品等措施都可以讓儀器性能處于最佳狀態(tài)，確保其性能維持在實驗所需要求內(nèi)。