利用LC-MS技術(shù)解析黑果枸杞、紅果枸杞代謝物的差異

彭玉嬌， 崔學(xué)宇*， 邵元元， 陳眾峰， 杜 瀟， 曾文萍， 崔婷婷

（1.南寧師范大學(xué) 廣西地標(biāo)作物大數(shù)據(jù)工程技術(shù)研究中心/北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西地表過程與智能模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530001；2.上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，上海201210）

寧夏是我國重要的枸杞產(chǎn)地，2018年其產(chǎn)量占我國枸杞總產(chǎn)量的40%，種植面積近7萬公頃，種植品種以紅果枸杞（Lycium barbarumL.）為主[1]，另有部分黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）種植[2]。黑果枸杞和紅果枸杞均為茄科枸杞屬多年生灌木，具有重要的藥用價(jià)值。目前，對黑果枸杞和紅果枸杞礦物質(zhì)、氨基酸、總蛋白質(zhì)等的差異有一定的報(bào)道[1，3-4]，但對其代謝物分析未見報(bào)道。在代謝物的層面對其進(jìn)行研究，有助于黑果枸杞和紅果枸杞的差異利用。

前人對枸杞的藥用價(jià)值已有一定的研究，黑果枸杞和紅果枸杞均有提高免疫力、抗疲勞等藥用功效[5-9]，黑果枸杞和紅果枸杞均富含枸杞多糖、黃酮、生物堿等活性成分。此外黑果枸杞果實(shí)中有天然的花青素成分[10-11]，對花青素的研究也是黑果枸杞研究的熱點(diǎn)問題[12-15]。另一方面，黑果枸杞和紅果枸杞均對干旱等逆境有一定的耐受性，具有一定的生態(tài)價(jià)值[16-17]。黑果枸杞和紅果枸杞在中藥上已有一定的應(yīng)用，但是主要代謝物的差異仍然不清晰。

本研究中利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）對寧夏黑果枸杞和紅果枸杞進(jìn)行研究，同時(shí)測定其總黃酮的含量，以期明確其主要代謝物差異，為黑果枸杞和紅果枸杞加工利用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本處理

2019年在寧夏中寧縣寧安鎮(zhèn)采樣，同一基地采集黑果枸杞和紅果枸杞，選擇4個(gè)基地作4次重復(fù)采樣。曬干后用50℃烘箱烘干后備用[1]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

LC-MS非靶向代謝組測試委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。具體操作包括樣品預(yù)處理、代謝物提取、LC-MS全掃描檢測、數(shù)據(jù)預(yù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

質(zhì)控（QC）樣本：所有樣本各取等量混合作為QC樣本。質(zhì)譜上機(jī)過程中，每4個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中插入一個(gè)QC樣本，QC樣本用于評價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中系統(tǒng)質(zhì)譜平臺的穩(wěn)定性。

本次實(shí)驗(yàn)的分析儀器為AB ExionLC超高效液相串聯(lián)AB TripleTOF 6600 plus高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。

總黃酮測試委托武漢佰莫生物科技有限公司完成，利用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇回流提取，蘆丁為對照品進(jìn)行顯色測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞和紅果枸杞中的代謝產(chǎn)物

黑果枸杞和紅果枸杞中合計(jì)檢測到12 754個(gè)物質(zhì)峰，包括負(fù)離子5 844個(gè)，正離子6 910個(gè)；根據(jù)數(shù)據(jù)庫可以比對出的代謝物為6 982種，包括負(fù)離子2 704個(gè)，正離子4 278個(gè)。比對出的部分代謝物種類如表1所示，由表可知，黑果枸杞有更多的代謝物以及特有的代謝物。

表1 黑果枸杞和紅果枸杞中鑒定到的代謝物質(zhì)Table 1 A list of metabolites identified in Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.

2.2 黑果枸杞和紅果枸杞的主成分分析（PCA）

利用主成分分析法 （Principle component analysis，PCA）對黑果枸杞、紅果枸杞和QC樣本的代謝物進(jìn)行主成分分析（見圖1），72.6%的變量可以被解釋，QC樣本緊密聚集，表明本實(shí)驗(yàn)有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；黑果枸杞和紅果枸杞同樣在組間聚集，證明了代謝物水平黑果枸杞和紅果枸杞可以被區(qū)分開。

圖1 代謝物的PCA圖Fig.1 PCA score plot of the metabolites

續(xù)表1

2.3 黑果枸杞和紅果枸杞的差異代謝物的篩選

利用正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）中的變量權(quán)重值（Variable important in projection，VIP）挖掘具有生物學(xué)意義的差異代謝物（VIP>1）；利用t檢驗(yàn)篩選黑果枸杞和紅果枸杞組間差異的顯著性（P<0.05）。本研究合計(jì)獲得501種差異代謝物，其中240種代謝物在黑果枸杞中表達(dá)上調(diào)，261種代謝物表達(dá)下調(diào)。對差異代謝物的P值、VIP和變異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）值進(jìn)行可視化，如圖2所示。

圖2 差異代謝物的火山圖（黑果枸杞、紅果枸杞）Fig.2 Volcano plot of the differential metabolites（Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.）

將顯著差異代謝物表達(dá)量進(jìn)行層次聚類（Hierarchical clustering），前50差異代謝物表達(dá)量可視化分析如圖3所示。在super class層級中，差異表達(dá)前50的代謝物包括1個(gè)生物堿及其衍生物，1個(gè)核苷、核苷酸及其類似物，2個(gè)有機(jī)雜環(huán)化合物，1個(gè)有機(jī)氧化合物，2個(gè)苯丙酸類和聚酮類化合物，4個(gè)含氧有機(jī)物，4個(gè)苯環(huán)型化合物，5個(gè)未確定分類化合物，6個(gè)有機(jī)酸及其衍生物，24個(gè)脂類及類脂分子。在sub class層級對其分析發(fā)現(xiàn)，脂類及類脂分子中的黃酮類（Flavonoids）物質(zhì)有7種物質(zhì)，這7種物質(zhì)分別是Isorhamnetin 3-gentiotrioside-7-glucoside、Kaempferide 3-rhamnoside-7-（6″-succinylglucoside）、Diffutin、Ranupenin 3-rutinoside、Quercetin 3-（6?-p-coumarylglucosyl）（1->2）-rhamnoside-7-glucoside、Kaempferol 3-rhamnosyl-（1->3）（4?-p-coumarylrhamnosyl）（1->6）-glucoside和Kaempferol 3-[2?-（E）-ferulylsophoroside]-7-glucoside；有機(jī)酸及其衍生物中的氨基酸和多肽類（Amino acids，peptides）有6種物質(zhì)，這6種物質(zhì)分別 是N-（1-Deoxy-1-fructosyl）tyrosine、N-（1-Deoxy-1-fructosyl） proline、N-（1-Deoxy-1-fructosyl） valine、 賴 諾 普 利 （Lisinopril）、NMalonyltryptophan和脯氨酸（L-Proline）。在紅果枸杞中表達(dá)更高的物質(zhì)有4種，分別是Diffutin、N-（1-Deoxy-1-fructosyl）proline、賴諾普利和脯氨酸。

圖3 前50差異代謝物的聚類熱圖Fig.3 Heatmap of the top 50 significant differential metabolites

2.4 代謝通路富集分析

差異前20的代謝通路如圖4所示，其中被極顯著富集的代謝通路有6個(gè)（紅線以上P＜0.01），這6個(gè)分別是氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids），ABC transporters， 氨 酰tRNA生 物 合 成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis），精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（Alanine，aspartate and glutamate metabolism），亞油酸代謝 （Linoleic acid metabolism）；顯著富集的代謝通路有5個(gè)（藍(lán)線與紅線之間P＜0.05），分別包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生 物 合 成 （Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis），苯丙素生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis），黃酮生物合成（Flavonoid biosynthesis），半乳糖代謝（Galactose metabolism）和檸檬酸循環(huán)（TCA cycle）。對11個(gè)顯著差異的代謝通路的富集分析如圖5所示。富集分析表明，富集的代謝物數(shù)量最多的途徑是氨基酸生物合成和ABC transporters，富集因子最大的途徑是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及亞油酸代謝。

圖4 差異代謝產(chǎn)物涉及的代謝途徑Fig.4 Distribution of metabolic pathways involved in the differential metabolites

圖5 富集到的代謝通路相關(guān)指標(biāo)（黑果枸杞、紅果枸杞）Fig.5 Related indexes of enriched metabolic pathways（Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.）

2.5 黑果枸杞和紅果枸杞氨基酸代謝相關(guān)物質(zhì)的差異

顯著差異的11個(gè)代謝通路中有4個(gè)涉及氨基酸代謝，對其相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行具體分析，其中共有15種差異代謝物參與，結(jié)果如表2所示，其中l(wèi)og2（FC）正值的物質(zhì)在黑果枸杞中上調(diào)，負(fù)值為下調(diào)。

表2 氨基酸代謝相關(guān)的差異代謝物（黑果枸杞、紅果枸杞）Table 2 A list of diferential metabolites of amino acid metabolism（Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.）

2.6 黑果枸杞和紅果枸杞氨總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及黃酮代謝相關(guān)物質(zhì)的差異

由于前50差異代謝物中數(shù)目最多的是黃酮類物質(zhì)，且黃酮生物合成這一代謝通路被顯著富集，所以對其總黃酮含量進(jìn)行測定。本研究中，黑果枸杞的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（24.43±0.18）mg/g，紅果枸杞的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（13.13±0.09）mg/g，黑果枸杞和紅果枸杞的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在極顯著差異（P＜0.01）。對其相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行具體分析，其中共有5種差異代謝物參與黃酮生物合成，結(jié)果如表3所示。

表3 黃酮生物合成代謝相關(guān)的差異代謝物（黑果枸杞、紅果枸杞）Table 3 A list of diferential metabolites of flavonoid biosynthesis （Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.）

2.7 討論

針對代謝物中相對分子質(zhì)量小于1 500的內(nèi)源性小分子的研究，以及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）的應(yīng)用越來越多[18-19]。本研究合計(jì)篩選出代謝物6 982種，黑果枸杞特有的物質(zhì)比紅果枸杞更多，有生物學(xué)意義的差異代謝物501種，鑒定到的物質(zhì)數(shù)遠(yuǎn)超傳統(tǒng)的提取方法，代謝物的PCA結(jié)果證明了黑果枸杞和紅果枸杞可以被顯著區(qū)分開，這一結(jié)果對黑果枸杞和紅果枸杞的差異利用提供理論支持。

枸杞黃酮是枸杞中重要的藥用活性物質(zhì)，有較強(qiáng)的抗氧化活性[20-22]。本研究中，差異表達(dá)前50的代謝物中黃酮類（Flavonoids）物質(zhì)有7種物質(zhì)在黑果枸杞和紅果枸杞中存在差異，有6種在黑果枸杞中顯著上調(diào)，黃酮生物合成相關(guān)的代謝通路也被顯著富集，5種相關(guān)物質(zhì)發(fā)生變化。對總黃酮含量測定發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞有更高的總黃酮含量，黑果枸杞可能有更好的抗氧化的作用。本研究為黑果枸杞、紅果枸杞黃酮的利用以及黃酮含量差異產(chǎn)生的原因提供一定參考。

前人對黑果枸杞和紅果枸杞的氨基酸含量進(jìn)行了一定的研究[23-24]，前人的研究證明了黑果枸杞和紅果枸杞中不同氨基酸含量存在一定差異[3]。本研究中，差異表達(dá)前50的代謝物中氨基酸和多肽類有6種，其中3種在黑果枸杞中表達(dá)更高。有研究表明，枸杞蛋白酶解液可以降低高血壓大鼠的血壓，但并未對其具體活性成分進(jìn)行研究[25]。賴諾普利是抗高血壓的重要藥物[26-28]，本研究發(fā)現(xiàn)紅果枸杞有更高含量的賴諾普利，該成分可能是枸杞蛋白酶解液可以降壓的活性成分之一，因此黑果枸杞和紅果枸杞在藥用選擇上應(yīng)該區(qū)別對待。此外，有4個(gè)顯著差異的代謝通路涉及氨基酸代謝，這一結(jié)果為黑果枸杞和紅果枸杞氨基酸差異可能的分子機(jī)理做出一定的解釋。

3 結(jié) 語

本研究得到的代謝物為6 982種，其中黑果枸杞特有的代謝物比紅果枸杞多。PCA分析發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞和紅果枸杞可以被顯著區(qū)分開；合計(jì)獲得501種差異代謝物，240種代謝物在黑果枸杞中表達(dá)上調(diào)，261種代謝物表達(dá)下調(diào)，前50差異代謝物中，有7種是黃酮類物質(zhì)，6種是氨基酸和多肽類物質(zhì)，其中調(diào)節(jié)血壓成分的賴諾普利在紅果枸杞中含量顯著比黑果枸杞高；對總黃酮的含量分析發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞有更高的總黃酮含量，5種差異代謝物參與到黃酮合成的代謝途徑中；共有11個(gè)代謝通路被顯著富集，其中15種差異代謝物參與4個(gè)氨基酸代謝相關(guān)通路，這些物質(zhì)的差異表達(dá)可能造成黑果枸杞和紅果枸杞氨基酸的差異。本研究為深入了解枸杞中的氨基酸代謝、黃酮代謝，以及對黑果枸杞和紅果枸杞的差異利用提供一定依據(jù)。