以糖蜜為原料利用雙酶法制備低聚果糖

潘 瑩， 甄遠航， 徐光輝， 謝凌波， 張 菡， 江 波*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.中糧屯河崇左糖業(yè)有限公司 廣西壯族自治區(qū)認定企業(yè)技術中心，廣西 崇左532200；3.中糧糖業(yè)控股股份有限公司 新疆維吾爾自治區(qū)甜菜制糖工程研究中心，新疆 昌吉831100）

糖蜜作為制糖業(yè)的加工副產(chǎn)品，是一種深褐色、呈黏稠狀、半流動的液體，僅在蔗糖加工過程中每年就能產(chǎn)生350萬噸的廢料糖蜜。糖蜜中可溶性碳水化合物質(zhì)量分數(shù)較高，含有40%～50%，蔗糖在所含糖類中質(zhì)量分數(shù)超過50%，還含有質(zhì)量分數(shù)8%～10%的礦物質(zhì)和少量的蛋白質(zhì)[1]。作為益生元的重要組成部分，低聚果糖（FOS）根據(jù)其結構可分為兩類：葡萄糖-果糖型（GFn）和果糖-果糖型（Fn），GFn型FOS一般由蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）組成[2]。FOS因具有良好的溶解性、熱穩(wěn)定性及較低的甜度，常用于提升食品口感與延長產(chǎn)品貨架期[3]。此外，優(yōu)良的保健功能和特殊的生理活性，如具有促進消化道有益菌的生長、吸附腸道病原菌、刺激機體產(chǎn)生免疫因子和提高飼料利用率等作用，使FOS逐漸被大眾所關注，并被視為取代抗生素的可能配料之一。因此，將糖蜜作為原料利用雙酶法制備低聚果糖具有重大意義[4-5]。

β-果糖基轉(zhuǎn)移酶（FTase，亦稱β-呋喃果糖苷酶）通過水解蔗糖分子上葡萄糖和果糖間的β（1→2）糖苷鍵，使果糖基與另一蔗糖分子連接而生成FOS[6]。Reddy等報道以2%（質(zhì)量分數(shù)）甘蔗糖蜜和0.5%（質(zhì)量分數(shù)）豆粕為底物，使Aspergillus nigerPSSF21產(chǎn)出的β-呋喃果糖苷酶（FFase）酶活最高，生成的主要產(chǎn)物為GF2和GF3[7]。以甜菜糖蜜為原料，Zhang通過發(fā)酵法制取低聚果糖，培養(yǎng)方法簡單易行，操作方便，但該方案中僅利用微生物產(chǎn)生的果糖基轉(zhuǎn)移酶水解糖蜜，長時間的發(fā)酵使低聚果糖含量大幅度降低，使低聚果糖在行業(yè)中的應用受到限制[8]。Khatun等鑒定出一種高效產(chǎn)低聚果糖的菌株Aureobasidium pullulan，以此作為全細胞生物催化劑，從而避免了昂貴的酶回收和純化的需要[9]。但菌株的培養(yǎng)及活化通常需要36～72 h，二級種子液也至少需要發(fā)酵72 h，耗費時間過長。糖蜜中含有10%（質(zhì)量分數(shù)）的膠體含量，其中膠體的主要成分是果膠質(zhì)，較高的膠體含量引起糖蜜黏度過大，導致糖蜜利用困難，因此利用果膠酶（Pectinase）去除果膠質(zhì)是糖蜜生產(chǎn)FOS的一個良好前提[10]。當前研究均以果糖基轉(zhuǎn)移酶為單一酶，而作者以糖蜜為原料，利用果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶為復合酶液，制備高轉(zhuǎn)化率的低聚果糖，提高了制糖副產(chǎn)物的利用率及附加值，降低了飼料級低聚果糖的生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖蜜：中糧屯河崇左糖業(yè)有限公司提供；D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖標準品：國藥集團化學試劑公司產(chǎn)品；蔗 果 三 糖（GF2）、蔗 果 四 糖（GF3）、蔗 果 五 糖（GF4）：Sigma公司產(chǎn)品；果膠酶（800 U/mL）、果糖基轉(zhuǎn)移酶（5 000 U/mL）：作者所在實驗室提供；所用其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

夾層酶反應器：上海申迪玻璃儀器有限公司產(chǎn)品；DF0825型浸入式高低溫恒溫循環(huán)裝置：南京百思禾生物科技有限公司產(chǎn)品；RVDV-II+P型黏度計：美國Brookfield公司產(chǎn)品；FE20型pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；FreeZone冷凍干燥機：美國Labconco公司產(chǎn)品；Carbolite馬弗爐：弗爾德（上海）儀器設備有限公司產(chǎn)品；K-360型凱氏定氮儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；Waters e2695高效液相色譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品成分分析及檢測方法蛋白質(zhì)含量測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法；總糖含量測定參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》中直接滴定法；水分含量測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中直接干燥法；灰分含量測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》。糖組分及含量測定通過高效液相色譜儀和示差折光檢測器聯(lián)用測定。色譜條件如下：色譜柱為ZORBAX NH2柱（Agilent，4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相配比為V（乙腈）∶V（水）=70∶30；流量1 mL/min；進樣量10μL；柱溫30℃。

1.3.2 糖蜜酶解液的制備方法取一定量的糖蜜制備為水溶液，將糖蜜與水混合后攪拌至糖蜜完全溶解于水中并調(diào)整其固形物質(zhì)量分數(shù)為50%，在一定的溫度及pH條件下加入果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復合酶液進行反應，定時取樣，通過高效液相色譜檢測溶液的糖分組成[11]。

1.3.3 不同復合酶液比例對FOS轉(zhuǎn)化率的影響取1 L溶解后的糖蜜水溶液在反應溫度為55℃、pH 5.5的條件下，加入12.5 mL不同比例的果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復合酶液（果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶體積比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1），并與單獨加入果膠酶及果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶解液進行比較，反應過程中定時取樣檢測低聚果糖的轉(zhuǎn)化率及黏度。

黏度測定：調(diào)節(jié)黏度計高度，使轉(zhuǎn)子逐漸浸入樣品中并穩(wěn)定3 min后開始測量，當2號轉(zhuǎn)子以100 r/min的轉(zhuǎn)速在液體中旋轉(zhuǎn)20圈后讀數(shù)，每個樣品測量3次。

1.3.4 不同反應溫度對FOS轉(zhuǎn)化率的影響將溶解后的糖蜜水溶液在反應溫度分別為40、45、50、55、60℃，pH 5.5的條件下，加入果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復合酶液（果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比為20∶1），反應過程中定時取樣檢測。

1.3.5 不同反應pH對FOS轉(zhuǎn)化率的影響將溶解后的糖蜜水溶液在反應溫度為55℃，pH分別控制為4.5、5.0、5.5、6.0的條件下，加入果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復合酶液（果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比為20∶1），反應過程中定時取樣檢測。

1.3.6 冷凍干燥將所得酶解液沸水浴滅酶10 min，F(xiàn)OS糖漿濃縮至80%（質(zhì)量分數(shù)）后放入真空冷凍干燥機內(nèi)，調(diào)節(jié)真空冷凍干燥機的溫度為-60℃，干燥得到固體。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0進行曲線擬合和SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結果與分析

2.1 糖蜜樣品成分分析

對糖蜜樣品的組成成分進行分析（見表1）。糖蜜中總糖的質(zhì)量分數(shù)為55.03 g/hg，其中蔗糖質(zhì)量分數(shù)為33.29 g/hg，占總糖質(zhì)量分數(shù)的60.5%，與報道結果基本吻合[12]。

表1 糖蜜樣品成分分析Table 1 Composition analysis of molasses

2.2 復合酶液比例對FOS轉(zhuǎn)化率的影響

研究了果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的比例對FOS轉(zhuǎn)化率的影響。由圖1可知，果膠酶單獨使用時對糖的組成幾乎沒有影響，果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的復配較單一使用果糖基轉(zhuǎn)移酶可以顯著提高FOS的轉(zhuǎn)化率，且反應10 h后FOS轉(zhuǎn)化率基本保持平衡。當果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比從10∶1增加到25∶1時，F(xiàn)OS的轉(zhuǎn)化率不斷增加，最高達41.5%。而果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比由20∶1增加到25∶1時，F(xiàn)OS的轉(zhuǎn)化率增加不明顯。因此，選用果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比為20∶1。袁偉崗[13]利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖時，當蔗糖質(zhì)量分數(shù)在45%～65%時，F(xiàn)OS的質(zhì)量分數(shù)最高可達40%。而本文中底物僅含約25%（質(zhì)量分數(shù)）的蔗糖即可達到相同的效果。

圖1 果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶不同添加比例對低聚果糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effects of different ratio of pectinase to FTase on recovery of FOS

2.3 反應溫度對FOS轉(zhuǎn)化率的影響

溫度過高會使維持酶蛋白空間構象的次級鍵發(fā)生斷裂從而導致酶變性失活，溫度太低則導致酶的轉(zhuǎn)化率降低[14]?？紤]到果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適反應溫度，研究了反應溫度對FOS轉(zhuǎn)化率的影響。由圖2可知，隨著反應溫度從40℃升至55℃時，F(xiàn)OS的轉(zhuǎn)化率逐漸升高，最高達35%。而隨著溫度進一步升高至60℃，F(xiàn)OS的轉(zhuǎn)化率有所下降。由此表明，酶反應的最佳溫度為55℃。當溫度低于55℃時，反應速率受到影響，當高于55℃時，由于酶的部分失活，產(chǎn)物的合成受到抑制，這也反映出酶的穩(wěn)定性與溫度呈一定的相關性[15]。Zhang[8]的研究結果表明，溫度對FOS的產(chǎn)量有顯著影響，發(fā)酵溫度為30℃時FOS產(chǎn)量達到最高，而升至35℃后，F(xiàn)OS的產(chǎn)量就下降了22%。

圖2 不同反應溫度對低聚果糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effects of temperatures on recovery of FOS

2.4 反應pH對FOS轉(zhuǎn)化率的影響

反應液的pH會影響酶和底物帶電情況，從而影響酶和底物的解離和結合。因此，研究了酶反應的pH對低聚果糖轉(zhuǎn)化率的影響，最終確定最適反應pH。由圖3可知，pH<5.0時，過酸的反應體系導致酶活力大幅度下降，因此FOS的轉(zhuǎn)化率也相應降低。同時，pH為6.0的反應環(huán)境對酶活力也有一定的影響，對生產(chǎn)高轉(zhuǎn)化率的FOS并無提高作用。因此，確定該反應的最適宜pH為5.0～5.5，這與Mouelhi等[16]的實驗結果相符。

圖3 不同反應p H對低聚果糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effects of p H on recovery of FOS

2.5 反應過程中黏度變化

流體黏度是液體流動時不同速度層分子間的動量傳遞及分子間引力作用所產(chǎn)生的內(nèi)摩擦的表現(xiàn)，與流體內(nèi)部的微觀分子作用有關[17]。在反應溫度55℃、pH 5.5的條件下，調(diào)節(jié)果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比在最適條件下，測定不同反應時間下溶液黏度的變化。由圖4可知，在反應初期，酶解液的黏度仍有2.9 mPa·s，隨著反應時間的延長，酶解液的黏度下降較快，當反應8 h后，反應體系黏度變化趨勢變緩，并趨于一個定值，其中一個原因是果膠酶的存在引起這一現(xiàn)象的發(fā)生[18]?？扇苄詷淠z作為糖蜜的成分之一，由于兩者之間的相互結合，形成一種相對穩(wěn)定的可溶性狀態(tài)液體。果膠酶可以通過降解其中的果膠物質(zhì)破壞其混合膠體的結構，使其轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇軤顟B(tài)，此時體系黏度則呈現(xiàn)較大幅度下降[19]。由反應進程可知，體系黏度的下降更易于酶反應的進行，傳質(zhì)狀況良好，使得反應過程中酶解液中FOS轉(zhuǎn)化率上升。

圖4 不同時間下反應體系黏度的變化曲線Fig.4 Viscosity curve of reaction system under different times

2.6 FOS固體粉末成分分析

在上述研究所得的最優(yōu)條件下反應制備所得的酶反應液，經(jīng)冷凍干燥后得到飼料級FOS固體粉末，并對其成分進行分析，結果如表2所示。與原樣品相比，經(jīng)過酶反應后，蔗糖占總糖質(zhì)量分數(shù)降低而低聚果糖占總糖質(zhì)量分數(shù)升高，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)與其他研究結果相似[20]。因此，所制備的FOS可以作為一種優(yōu)質(zhì)的無抗生素飼料資源。

表2 FOS固體粉末成分分析Table 2 Composition analysis of FOSsolid powder

3 結語

為了提高糖蜜的加工價值，擴大其應用范圍，作者利用果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復合酶液，確定了酶解糖蜜生產(chǎn)FOS的最佳條件，并通過真空冷凍干燥制備低聚果糖固體粉末。該法的最優(yōu)反應條件為果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶體積比為20∶1、反應溫度55℃、pH 5.5、酶解時間10 h，F(xiàn)OS轉(zhuǎn)化率可達45%。干燥后的固態(tài)低聚果糖粉，比液態(tài)低聚果糖更利于運輸，因而減少了運輸成本，具有更廣泛的應用范圍；該固態(tài)低聚果糖可以作為食品和飼料的添加劑，具有優(yōu)質(zhì)的加工性能，從而提高制糖工業(yè)經(jīng)濟效益，為廢棄物的進一步綜合利用提供較好的途徑，符合國家提倡的循環(huán)經(jīng)濟發(fā)展理念。