衍生化-頂空固相微萃取-氣相色譜法測定大鼠糞便中游離短鏈脂肪酸

張曉偉，孫鑫，李秀娟，潘思軼

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)是腸道菌群重要代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，約5%～10%的SCFAs被排泄在糞便中，90%以上的SCFAs在盲腸和結(jié)腸中被吸收，參與生命活動代謝，在維持腸道穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)宿主代謝及免疫應(yīng)答和一些相關(guān)性疾病中發(fā)揮重要作用[3-4]。糞便是目前研究SCFAs應(yīng)用最為廣泛的生物樣品，其SCFAs濃度與結(jié)腸狀態(tài)和腸道菌群密切相關(guān)，是腸道菌群監(jiān)測、腸道疾病及代謝性疾病早期診斷的重要手段[5-6]。然而，SCFAs理化性質(zhì)獨特，含量較低且糞便等生物樣品基質(zhì)復(fù)雜等因素使得SCFAs的準(zhǔn)確定量十分困難[7]。因此，建立操作簡單、靈敏度高及分析成本低的檢測方法對于糞便中SCFAs的分析具有重要意義。

氣相色譜法 (gas chromatography,GC) 是目前分析SCFAs最為常用的方法[8-10]，但是SCFAs極性較強，易在色譜柱中產(chǎn)生吸附(尤其在低濃度時)，導(dǎo)致檢測結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較差[9]。因此，常常會將SCFAs衍生化后再通過有機溶劑萃取，經(jīng)脫水或濃縮后進行GC分析，但此過程中SCFAs 衍生物極易逸失，回收率偏低[10]，而且過量衍生試劑也會對色譜柱造成損害。采用固相微萃取技術(shù)(solid-phase microextraction,SPME)可以改善上述狀況，還可以大大提高方法的靈敏度，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及生物領(lǐng)域中痕量化合物的檢測[11-12]。但是衍生化SPME結(jié)合用于分析生物樣品中SCFAs的報道并不多，并且還存在一些不足：回收率偏低、準(zhǔn)確度不佳、衍生反應(yīng)條件苛刻、安全性差、衍生操作繁瑣、耗時及分析成本高等[13-16]。

目前用于SCFAs衍生的試劑有五氟芐基溴(pentafluorobenzyl bromide,PFBBr)[17-18]、三甲基甲硅烷試劑(trimethylsilyl,TMS)[19]、烷基氯甲酸酯類[20-23]等。其中，烷基氯甲酸酯類因衍生操作簡單、快速、條件溫和、價格便宜等優(yōu)點，被廣泛用于SCFAs衍生[20]。Furuhashi等[20]和Zheng等[21]發(fā)現(xiàn)氯甲酸丙酯(propylchloroformate,PCF)衍生效率較佳，衍生物在色譜中分離好，獲得了較好的分析結(jié)果。但是他們使用糞便提取液進行衍生化，再采用液液萃取分離純化，操作過程極為繁瑣，需用大量有機試劑進行多次分離轉(zhuǎn)移，目標(biāo)物極易逸失，導(dǎo)致分析物回收率偏低，且檢出限較高，可能無法滿足生物樣品中痕量SCFAs的檢測[20-21]。

因此，為改善傳統(tǒng)GC法不足，更加適用于SCFAs的痕量檢測，本研究以PCF為衍生試劑，結(jié)合HS-SPME，建立基質(zhì)內(nèi)衍生-頂空固相微萃取-氣相色譜方法用于大鼠糞便中游離SCFAs的測定，以期為腸道菌群與健康研究提供技術(shù)支撐，并為血液及組織等生物樣品中SCFAs的痕量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠糞便由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心提供。

乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、2-甲基戊酸(>98%)及PCF(>99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正丙醇、吡啶(分析純)，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；超純水。

使用超純水配制SCFAs混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，每種標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量濃度為1 mg/mL。將儲備溶液進一步稀釋至一系列濃度制備混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在超純水中制備2-甲基戊酸儲備溶液(0.1 mg/mL)，將其用作內(nèi)標(biāo)(IS)。所有標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和所有工作溶液均存儲于4 ℃。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-7890型氣相色譜儀(配氫火焰離子化檢測器，F(xiàn)ID)，山東魯南瑞虹化工有限公司；N2000色譜工作站，浙江大學(xué)智達信息工程有限公司；SE-54毛細管柱(30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)，蘭州中科安泰分析科技有限公司；CT-1型氮氫空氣發(fā)生器，武漢科林普豐儀器有限公司；QL-861型漩渦混合器，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；XHF-D高速分散器內(nèi)切式勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，武漢德力祥儀器設(shè)備有限公司。

65 μm羥基硅油-甲基丙烯酸丁酯-二乙烯苯基 (hydroxy-terminated silicone oil-butyl methacrylate-divinylbenzene,OH-TSO-BMA-DVB)萃取頭參考文獻[24]制備。

氣相色譜條件：以高純氮氣為載氣，柱頭壓0.10 MPa，空氣0.095 MPa，氫氣0.065 MPa，尾吹氣0.075 MPa，分流比為20∶1。進樣口溫度280 ℃，F(xiàn)ID溫度290 ℃。升溫程序：初始溫度70 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升至120 ℃，以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。

1.3 糞便中SCFAs提取、衍生和頂空固相微萃取操作方法

隨機收集Wistar大鼠的新鮮糞便于離心管內(nèi)，密封并于-80 ℃凍存。糞便基質(zhì)內(nèi)SCFAs的提取參考Zheng等[21]的方法并加以調(diào)整。取-80 ℃ 凍存的糞便，以料液質(zhì)量比1∶10，加入超純水(含 10 μg/mL 的2-甲基戊酸作為內(nèi)標(biāo))，勻漿10 min。稱取1.1 g樣品懸濁液，加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8，依次加入100 μL吡啶、300 μL丙醇和100 μL PCF，渦旋2 min進行衍生。衍生完畢后，加入鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值為3，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，轉(zhuǎn)速1 000 r/min、溫度60 ℃，采用OH-TSO-BMA-DVB萃取頭萃取30 min，然后取出萃取頭于280 ℃ 下GC氣化室解吸5 min。所有試驗均做3次平行，結(jié)果取平均值。

取-80 ℃ 凍存的糞便，以料液質(zhì)量比1∶4加入超純水(含 10 μg/mL 的2-甲基戊酸作為內(nèi)標(biāo))，勻漿10 min，加入一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液渦旋混勻，在4 ℃下放置12 h以模擬真實樣品，再加入一定量超純水(含 10 μg/mL 的2-甲基戊酸)使以料液質(zhì)量比為1∶10。按照上述操作，分別對影響衍生的因素(pH、吡啶、丙醇及PCF)和頂空固相微萃取的因素(萃取溫度、萃取時間、pH及轉(zhuǎn)速)進行優(yōu)化。

1.4 方法建立與評價

采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)加入法定量。按本文“1.3”方法在樣品中加入一系列不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入內(nèi)標(biāo)，在4 ℃下放置12 h，按照最佳條件進行衍生和HS-SPME操作。以各組分加標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，以各組分峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比的平均值為縱坐標(biāo)建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)3δ/S(δ為儀器空白響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為采用不含內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)加入法建立的校正曲線的斜率)求得方法的檢出限，定量限(limit of quantification,LOQ)為10δ/S。

通過內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)加入法定量，采用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線與橫坐標(biāo)的交點的絕對值即為真實樣品中SCFAs的濃度。采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)加入法計算試驗方法的回收率。在真實樣品中分別添加各SCFAs線性范圍內(nèi)高、中、低3個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)條件下，重復(fù)測定3次得到各組分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計算出濃度，與加標(biāo)濃度的比值即為方法的加標(biāo)回收率。精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2016版本軟件，繪圖采用ChemDraw 19.0和Origin 2018版本軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞便中SCFAs的衍生條件優(yōu)化

圖1顯示了SCFAs的PCF衍生過程。為了獲得滿意的衍生化效果和萃取效果，對衍生條件進行了優(yōu)化。

1)衍生輔助方式。SCFAs衍生效果與衍生試劑添加速率及衍生體系的搖動程度有關(guān)。為此，比較了超聲和渦旋2種輔助方式，如圖2所示，渦旋更有利于糞便中SCFAs的衍生。進一步考察了渦旋時長對衍生反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)渦旋1 min即可滿足衍生需要，但是當(dāng)渦旋2 min時，結(jié)果的重現(xiàn)性更好，因此選擇渦旋2 min用于后續(xù)研究。

圖1 氯甲酸丙酯衍生短鏈脂肪酸的示意圖Fig.1 Schematic representation of derivatization of SCFAs with PCF

1：乙酸； 2：丙酸； 3：異丁酸； 4：丁酸； 5：異戊酸； 6：戊酸； 7：己酸。下同。1:Acetic acid; 2:Propionic acid; 3:Isobutyric acid; 4:Butyric acid; 5:Isovaleric acid; 6:Valeric acid; 7:Caproic acid. The same as below.

2)pH。體系pH是影響衍生化反應(yīng)的重要因素之一。在最初的試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH過高時，PCF水解，衍生效果較差，各目標(biāo)物的萃取量較低。因此，將衍生體系pH值分別設(shè)置為6、7、8、9和10，考察pH值對衍生反應(yīng)的影響。如圖3所示，當(dāng)溶液pH值在8～9時，衍生效果較佳。綜合考慮，選擇pH 8用于后續(xù)試驗。

3)吡啶加入量。吡啶是烷基氯甲酸酯類衍生化反應(yīng)中常用的催化劑。圖4考察了不同吡啶加入量對糞便中SCFAs衍生的影響。當(dāng)吡啶加入量從50 μL增加至100 μL時，所有SCFAs的衍生率大幅度上升，在100～150 μL時衍生率上升較慢，而后開始下降。這是因為吡啶呈堿性，過多使用吡啶會影響體系pH，導(dǎo)致衍生效果變差；而且過多的吡啶會損壞萃取涂層，使涂層萃取效果下降。綜合考慮，選擇100 μL吡啶用于后續(xù)試驗。

圖3 pH對糞便中游離SCFAs衍生的影響Fig.3 The effect of pH on the derivatization of free SCFAs in feces

圖4 吡啶加入量對糞便中游離SCFAs衍生的影響Fig.4 The effect of pyridine addition on the derivatization of free SCFAs in feces

4)丙醇加入量。過量的丙醇可以使衍生反應(yīng)完全，但是丙醇用量過多，會降低衍生體系極性，增加衍生物在溶劑中的溶解度，減少衍生物萃取量。圖5考察了丙醇對SCFAs衍生反應(yīng)的影響，選擇300 μL丙醇用于后續(xù)試驗。

圖5 丙醇加入量對糞便中游離SCFAs衍生的影響Fig.5 The effect of propanol addition on the derivatization of free SCFAs in feces

5)氯甲酸丙酯加入量。衍生試劑的用量對衍生反應(yīng)的影響比較復(fù)雜。圖6考察了PCF加入量對糞便中SCFAs衍生的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)衍生試劑用量大于100 μL時，衍生物的萃取量下降。過多的衍生試劑會產(chǎn)生更多的副產(chǎn)物，干擾衍生反應(yīng)進行，也影響涂層對衍生物的萃取效果，造成衍生試劑峰拖尾，導(dǎo)致背景噪音增加，對衍生物的檢測造成影響。所以，選擇100 μL PCF用于后續(xù)研究。

圖6 氯甲酸丙酯加入量對糞便中游離SCFAs衍生的影響Fig.6 The effect of propylchloroformate addition on the derivatization of free SCFAs in feces

2.2 頂空固相微萃取條件優(yōu)化

1)萃取溫度。萃取溫度是影響SPME的重要因素之一。如圖7所示，萃取溫度升高會加快SCFAs衍生物從樣品基質(zhì)向頂空的傳遞速率，增強了涂層的萃取效果，但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高，分析物在涂層與基質(zhì)間的分配常數(shù)降低，導(dǎo)致分析物的萃取量下降，而且溫度過高也會導(dǎo)致衍生物的水解，降低衍生物的萃取量。因此，選擇萃取溫度為50 ℃用于后續(xù)研究。

圖7 溫度對糞便中游離SCFAs衍生物萃取的影響Fig.7 The effect of temperature on the extraction of the SCFAs derivatives in feces

2)萃取時間。由圖8可知，隨著萃取時間的增加，各SCFAs衍生物的萃取量逐漸增加，在40 min達到萃取平衡；當(dāng)繼續(xù)延長萃取時間到70 min,各目標(biāo)物的重現(xiàn)性變差，甚至乙酸的萃取量開始下降，可能是長時間的水浴加熱導(dǎo)致衍生物開始水解造成。所以，選擇40 min作為萃取時間用于后續(xù)研究。

圖8 萃取時間對糞便中游離SCFAs衍生物萃取的影響Fig.8 The effect of extraction time on the extraction of the SCFAs derivatives in feces

3)攪拌速度。攪拌可以提高分析物的傳遞速率，縮短萃取時間，提高萃取效果，但攪拌時一定要保持速度的均勻性和一致性，否則將會導(dǎo)致分析物的萃取量下降或者重復(fù)性變差。由圖9可知，隨著攪拌速度增加，SCFAs衍生物的萃取量逐漸增加，并在轉(zhuǎn)速為1 000 r/min時，達到最佳萃取效果；當(dāng)繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速時，由于轉(zhuǎn)速過高，磁子不均勻轉(zhuǎn)動甚至跳動，從而導(dǎo)致各目標(biāo)物的萃取量下降。

圖9 轉(zhuǎn)速對糞便中游離SCFAs衍生物萃取的影響Fig.9 The effect of rotating speed on the extraction of the SCFAs derivatives in feces

4)pH。pH對衍生反應(yīng)和SPME的影響是不同的。圖10反映了衍生后體系的pH對SCFAs衍生物萃取的影響。衍生完成后體系的pH呈弱酸性，在4.19左右，通過加入一定濃度的NaOH溶液或HCl溶液調(diào)節(jié)體系pH，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH為3.46時，涂層對衍生物的萃取效果最佳。當(dāng)pH值小于或者大于3.46時，衍生物的萃取量明顯下降，可能因為pH較低或較高會導(dǎo)致SCFAs衍生物的水解，或?qū)е卵苌镌谌芤褐须婋x，影響萃取。

圖10 不同pH對糞便中游離短鏈脂肪酸衍生物萃取的影響Fig.10 The effect of pH on the extraction of the SCFAs derivatives in feces

2.3 方法建立與評價

在大鼠糞便懸濁液中添加不同濃度的SCFAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)，在最佳衍生條件和頂空固相微萃取條件下，建立氯甲酸丙酯衍生-頂空固相微萃取-氣相色譜檢測方法，結(jié)果見表1。7種SCFAs的線性范圍很寬，決定系數(shù)R2均大于0.99，所建方法的LOD在0.133～0.420 μmol/kg，LOQ在0.444～1.400 μmol/kg，連續(xù)5次重復(fù)試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)在7.63%～12.84%。

表1 7種短鏈脂肪酸的線性范圍、決定系數(shù)、檢出限、定量限和精密度 Table 1 Linear linearities,coefficients of determination,LOD,LOQ and precision of 7 kinds of SCFAs

隨機收集大鼠糞便，按照所建方法測定其中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸的含量分別為12.51、6.26、0.36、1.80、0.35、0.17和0.61 μmol/g。

向該樣品中添加高、中、低3種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，計算加標(biāo)回收率，以驗證方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果如表2所示。除異戊酸和己酸的低濃度加標(biāo)回收率較低外，該方法的加標(biāo)回收率都在65.42%～117.69%，RSD≤11.60%，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。由圖11A和11B可知，該方法用于實際樣品和加標(biāo)樣品(每種SCFAs的添加量均為500 μg/g) 分析時，7種SCFAs在此衍生條件下，衍生效果較好，譜圖較為干凈，沒有衍生試劑峰拖尾及背景噪音增加現(xiàn)象，衍生物分離度好，不會對衍生物的檢測造成影響。

表2 方法的回收率與精密度 Table 2 Recovery and precision of the proposed method

IS：內(nèi)標(biāo)物2-甲基戊酸。IS:Internal standard 2-methyl valeric acid.

3 討 論

本研究以PCF為衍生試劑，建立了衍生化-頂空固相微萃取-氣相色譜法分析大鼠糞便中游離短鏈脂肪酸。由表3可知，相對于現(xiàn)有的SPME法、衍生化-液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)-直接進樣法[18-19]及LLE-直接進樣法[25-26]等方法，本方法具備操作簡單、快速、省時、精密度好、靈敏度高等優(yōu)點。同時本方法采用基質(zhì)內(nèi)衍生，結(jié)合HS-SPME進行富集萃取，有效減少了大量有機試劑的使用及在分離提取過程中衍生物的損失，降低了過量衍生試劑對色譜柱的損害。此外，本方法對儀器要求不高，采用GC-FID設(shè)備即可滿足糞便中SCFAs的檢測需求。

將本方法用于隨機收集的大鼠糞便中SCFAs的檢測，測得其中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸的含量分別為12.51、6.26、0.36、1.80、0.35、0.17和0.61 μmol/g。而Fiorini等[27]在大鼠糞便中測得上述物質(zhì)含量及范圍分別為58.99(27.31～108.12)、8.93(4.44～15.58)、2.43(1.45～4.20)、1.43(0.91～2.18)、0.41(0.26～0.62)、0.67(0.42～1.07)和0.39(0.26～0.60) μmol/g；Scortichini等[26]在大鼠糞便中測得上述物質(zhì)含量及范圍分別為135.00(118.10～161.60)、15.70(13.30～19.40)、1.80(1.00～2.20)、34.90(26.00～47.80)、2.00(1.60～2.20)、2.50(1.70～2.90)和2.30(1.40～3.10) μmol/g，3種方法所得結(jié)果相差很大，而本方法測得的結(jié)果與Fiorini等[27]的結(jié)果較為接近，但也存在差異，這可能是樣品來源不同造成的，而且樣品收集、保存方法也會造成影響。

研究表明在正常成年人糞便中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸和己酸的平均濃度分別為40、15、13、2、2.5、2.0和0.5 mmol/kg糞便[5]，說明所建立的方法能夠滿足人類糞便中SCFAs的檢測需求。相比于糞便，血液、生物組織等生物樣品中SCFAs的豐度及含量更低，檢測更為困難。將本方法與目前現(xiàn)有的血液中的SCFAs檢測方法[19,28]相比，發(fā)現(xiàn)本方法亦可滿足血液中SCFAs的檢測需求，不過，仍需要進一步探究本方法在血液、組織等生物樣品中檢測的適用性，但其對血液、組織等生物樣品中的SCFAs痕量檢測也提供了參考價值。

表3 本方法與文獻中SCFAs檢測方法對比 Table 3 Comparison of the proposed method with other methods reported in literatures for determination of SCFAs