枯草芽孢桿菌L1-21在柑橘上的定殖能力及其防治綠霉病效果

李健，何鵬飛，李詠梅，吳毅歆，何鵬搏， 孔寶華，李興玉，MUNIR Shahzad,何月秋

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201； 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)廣泛存在，且較安全[1]，其發(fā)酵產(chǎn)品易于運(yùn)輸貯藏、貨架期長(zhǎng)，是目前注冊(cè)并商業(yè)化生產(chǎn)使用最多的生防菌劑[2]，在替代或減少化學(xué)農(nóng)藥使用、保護(hù)環(huán)境、維護(hù)生態(tài)平衡、物種多樣性和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[3]，如植物病害防治[4]、植物促生長(zhǎng)[5-6]、采后果實(shí)病害防控及保鮮[7]等方面，均有報(bào)道。枯草芽孢桿菌L1-21(下稱L1-21)是一株來(lái)自溫州蜜柑“新津”品種的內(nèi)生菌，它對(duì)柑橘黃龍病菌有較好的抑制效果[8]，對(duì)多種常見病原細(xì)菌及真菌都有顯著抑菌活性，且能定殖于多種作物體內(nèi)[9]，應(yīng)用潛力巨大。為了更好地在田間應(yīng)用該菌株并為施用方法提供理論依據(jù)，筆者開展了枯草芽孢桿菌L1-21進(jìn)入柑橘葉片、果實(shí)的速度及其防治果實(shí)綠霉病效果的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

供試菌株為L(zhǎng)1-21的綠色熒光標(biāo)記菌株L1-21-GFP，來(lái)自筆者所在實(shí)驗(yàn)室。該菌株熒光標(biāo)記穩(wěn)定性好，生長(zhǎng)速度和代謝特性及防控病害能力與野生型相同。綠霉病病原菌(Penicilliumdigitatum)為實(shí)驗(yàn)室自主分離并保存。柑橘植株為溫州蜜柑“新津”，生長(zhǎng)于大棚溫室。柑橘果實(shí)品種為新津、砂糖橘、塘房橘、沃柑、椪柑、清香橘及冰糖橙,均購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

L1-21-GFP培養(yǎng)于LB液體和固體培養(yǎng)基，綠霉病菌培養(yǎng)于馬鈴薯蔗糖液體(PS)和固體培養(yǎng)基(PSA)。

1.2 L1-21-GFP的培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱取出L1-21-GFP甘油保存菌，待其呈熔融狀態(tài)后，劃線接種到含氯霉素(終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，下同)的LB瓊脂培養(yǎng)基平板中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落于三角瓶中，在35 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d，在含有氯霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)并確定培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度。

1.3 L1-21-GFP進(jìn)入葉片時(shí)間與定殖量測(cè)定

將L1-21-GFP菌株濃度調(diào)至106cfu/mL，晴天下午18:30噴施于柑橘植株葉片，接種量以葉面無(wú)液滴下滑為度。分別于全株噴施結(jié)束后的10 min、20 min、30 min、40 min、1 h、4 h、6 h、8 h、18 h、22 h以及48 h，每次隨機(jī)采集3片葉。按采樣時(shí)間分別裝入保鮮袋中，立即放入4 ℃冰箱貯存或放置冰上。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用千分之一的分析天平稱量出葉片的質(zhì)量，在A4白紙上臨摹葉片，在葉片形狀中標(biāo)注編號(hào)，剪下葉片留下的形態(tài)，稱量紙片質(zhì)量，按照A4紙單位質(zhì)量面積(142.85 cm2/g),計(jì)算出葉片面積(S)，并做好數(shù)據(jù)的記錄。對(duì)于各時(shí)間段所采集的葉片，用3 mL的無(wú)菌水漂洗，回收漂洗液后按10倍梯度稀釋，取200 μL漂洗稀釋液在含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上涂布。37 ℃培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算出菌體的單位葉面積濃度(cfu/cm2)。

將上述使用無(wú)菌水漂洗過(guò)表面的柑橘葉片置于1%(有效氯)NaClO溶液中消毒2 min、75%乙醇溶液中消毒2 min以殺死葉表微生物。無(wú)菌水漂洗4次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面殘余水分，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌研缽內(nèi)。按照葉片質(zhì)量加入無(wú)菌水，仔細(xì)研磨成勻漿狀，按10倍梯度稀釋，隨后取200 μL葉肉組織研磨稀釋液，在含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上涂布，37 ℃培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算出菌體在葉肉內(nèi)的單位面積濃度(cfu/cm2)。

1.4 L1-21-GFP在柑橘植株上向下傳導(dǎo)能力測(cè)定

噴施3株樹(3重復(fù))，每株頂部單梢噴施約10片葉，并做好記錄，用報(bào)紙和紙袋(塑料袋)包裹其他葉片，以防被污染。分別于單梢噴施結(jié)束后的1、2、8、16、22、30 h，每株樹上、中、下各取1片未噴施的葉片，余下操作步驟同本文“1.3”。

1.5 L1-21-GFP在柑橘果實(shí)內(nèi)的定殖試驗(yàn)

1)L1-21-GFP在本主寄主果實(shí)中的定殖試驗(yàn)。L1-21-GFP的培養(yǎng)方法同本文“1.2”一致，濃度調(diào)整為108cfu/mL，選擇大小適宜、色澤均勻的新津柑橘果實(shí)，自來(lái)水沖洗表面2 min后用吸水紙吸干，用75%乙醇消毒2 min后無(wú)菌水漂洗4次，并用無(wú)菌濾紙吸干，分別噴施菌液及浸泡L1-21-GFP處理1、5和10 h，取出后，用無(wú)菌濾紙吸干，無(wú)菌下各稱取1 g果皮和果肉，分別加入9 mL無(wú)菌水研磨成勻漿，按10倍梯度稀釋，取200 μL稀釋液涂布于含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上,余下操作步驟同本文“1.3”。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)使用18個(gè)果實(shí)，計(jì)算菌含量。

2)L1-21-GFP在不同品種柑橘果皮及果肉內(nèi)的定殖。所選品種為砂糖橘、塘房橘、沃柑、椪柑、清香橘及冰糖橙，果實(shí)的消毒處理同本文“1.5 1)”，L1-21-GFP濃度為108cfu/mL，果實(shí)浸泡30 min后取出放置于37 ℃培養(yǎng)箱，并在培養(yǎng)后的6、24及48 h于無(wú)菌條件下分離果皮及果肉，余下步驟同本文“1.5 1)”。

1.6 L1-21-GFP對(duì)綠霉病的防效測(cè)定

選用砂糖橘果實(shí)按本文“1.5”消毒及浸泡，L1-21-GFP濃度為108cfu/mL，果實(shí)浸泡30 min后取出，并在其赤道附近用針刺法刺一直徑約3 mm、深度約5 mm的小洞，接入20 μL綠霉病菌孢子液，濃度為102cfu/mL，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在處理后3 d和5 d時(shí)統(tǒng)計(jì)果實(shí)發(fā)病率，并計(jì)算防效，以浸泡液體LB的果實(shí)為對(duì)照，3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)90個(gè)果實(shí)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

L1-21-GFP的定殖數(shù)據(jù)用Excel及IBM SPSS Statistics 20.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析，采用 Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(P<0.05)，用GraphPad Prism 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 L1-21-GFP進(jìn)入葉片時(shí)間與定殖量

整體來(lái)看(表1)，L1-21-GFP的定殖數(shù)量呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。葉肉中的定殖數(shù)量從10 min到48 h逐漸增加，10 min在葉肉內(nèi)定殖數(shù)量為8.08×102cfu/cm2，48 h時(shí)定殖數(shù)量達(dá)到1.43×104cfu/cm2；L1-21-GFP在葉表的定殖呈現(xiàn)先增加后降低再增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，從10 min到40 min菌含量逐漸增加，10 min時(shí)定殖量為1.36×103cfu/cm2，1 h時(shí)其定殖量降低為1.81×103cfu/cm2，隨后逐漸增加，到8 h時(shí)定殖量達(dá)1.97×104cfu/cm2，18 h時(shí)雖有降低，但其菌含量亦達(dá)到1.39×104cfu/cm2，至22～48 h，定殖量變化不大。

表1 葉片中L1-21-GFP的定殖數(shù)量 Table 1 Colonization number of L1-21-GFP in leaves cfu/cm2

2.2 L1-21-GFP在柑橘植株上向下的傳導(dǎo)能力

頂部單梢噴施，檢測(cè)下部未噴施的葉片，結(jié)果顯示L1-21-GFP在葉表中的定殖量變化較為平穩(wěn)(表2)，其范圍在1.51×102cfu/cm2(1 h)到4.29×102cfu/cm2(2 h)之間；在葉肉中，1 h取樣時(shí)，L1-21-GFP的定殖量為0，從2 h到30 h，定殖量逐漸增加，30 h定殖量達(dá)到1.15×103cfu/cm2。

表2 L1-21-GFP向下傳導(dǎo)到葉片的數(shù)量 Table 2 The number of L1-21-GFP transmitted downward to leaves cfu/cm2

2.3 L1-21-GFP在柑橘果實(shí)內(nèi)的定殖量

1)L1-21-GFP在本主寄主果實(shí)中的定殖量。L1-21來(lái)自早熟溫州蜜柑品種新津(本主寄主)。噴施及浸泡新津果實(shí)處理證明L1-21-GFP能在新津果實(shí)內(nèi)定殖(表3)；在噴施處理下于不同時(shí)間段取樣，L1-21-GFP在果皮中比果肉中的定殖量高，但各自在3個(gè)時(shí)間段里無(wú)顯著差異。在浸泡處理中，果皮中菌量大于果肉。在1 h后L1-21-GFP在果皮內(nèi)和果肉中的定殖量分別為3.51×104cfu/g和9.51×103cfu/g，與浸泡5 h及10 h處理果實(shí)無(wú)顯著性差異，即處理果實(shí)浸泡1 h，L1-21-GFP菌量達(dá)到每克組織103～104cfu。

表3 L1-21-GFP在新津果皮及果肉內(nèi)的定殖數(shù)量 Table 3 Colonization number of L1-21-GFPin peel and pulp of Citrus cv Xinjin

2)L1-21-GFP在不同品種柑橘果皮及果肉內(nèi)的定殖量。采用不同品種的柑橘果實(shí)浸泡30 min，取出置于37 ℃溫箱培養(yǎng)，在6、24及48 h檢測(cè)果皮及果肉內(nèi)L1-21-GFP的含量的結(jié)果(表4)顯示：L1-21-GFP均能在不同柑橘品種果實(shí)內(nèi)定殖，但是不同品種間，其定殖能力存在差異；在培養(yǎng)6～48 h，L1-21-GFP在椪柑果皮中定殖量最高，達(dá)到3.67×103～2.03×104cfu/g，其次是砂糖橘2.22×103～1.88×104cfu/g；總體上隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，定殖的菌量有所增加，但至24 h后，果肉中的定殖量略高于48 h，但差異未達(dá)顯著水平。

表4 L1-21-GFP在不同柑橘果實(shí)中的定殖數(shù)量 Table 4 Colonization number of L1-21-GFP in different Citrus varieties fruits 102 cfu/g

3)L1-21-GFP對(duì)綠霉病的防效。先接種L1-21后接種綠霉菌，3 d和5 d時(shí)統(tǒng)計(jì)防效結(jié)果(表5)。由表5可見，處理3 d后，空白對(duì)照81.67%果實(shí)顯癥，已出現(xiàn)少量綠霉，而以L1-21-GFP處理的果實(shí)未出現(xiàn)綠霉癥狀，防效100%；處理5 d后，空白對(duì)照96.39%果實(shí)顯癥，以L1-21-GFP處理的果實(shí)18.88%顯癥，防效達(dá)80.36%。本結(jié)果是依據(jù)果實(shí)發(fā)病率(圖1)來(lái)計(jì)算的，如果按發(fā)病面積來(lái)計(jì)算，所得到的防效應(yīng)該更高。

表5 L1-21-GFP防治柑橘果實(shí)綠霉病的效果 Table 5 Control effect of L1-21-GFP on citrus green mold %

A.處理組3 d； B.對(duì)照組3 d； C.處理組5 d； D.對(duì)照組5 d。A.Treatment after 3 d; B.Negative control after 3 d; C.Treatment after 5 d; D.Negative control after 5 d.

3 討 論

枯草芽孢桿菌作為一種重要的生防資源，可在植物根際土壤、根系及地上部組織等多個(gè)位置定殖。殷幼平等[10]研究結(jié)果表明噴施后立即測(cè)定，CQBS03-p HY43G在柑橘葉片上的定殖數(shù)量最高為6.80×104cfu/g，而后從0 d到42 d菌株定殖量逐漸下降；為有效排除其他細(xì)菌對(duì)枯草芽孢桿菌L1-21定殖計(jì)數(shù)結(jié)果的干擾，本研究選用了106cfu/mL濃度的枯草芽孢桿菌L1-21的綠色熒光標(biāo)記菌株，結(jié)果證明該菌株可迅速在柑橘葉片內(nèi)定殖，10 min定殖量分別為1.36×103cfu/cm2(葉表)和8.08×102cfu/cm2(葉肉)，究其原因一方面可能是L1-21菌株作為柑橘內(nèi)生細(xì)菌，與寄主植物有天然的良好互作共生關(guān)系，與異源寄主內(nèi)生菌相比，宿主內(nèi)生細(xì)菌的快速定殖易于其搶占有利的生態(tài)位點(diǎn)，為發(fā)揮高效的生防作用奠定基礎(chǔ)；另一方面噴施接種時(shí)間為晴天傍晚18：30，菌株受到溫度、濕度、紫外線等環(huán)境因素變化的影響較小，這可為指導(dǎo)田間的使用提供依據(jù)。不同于殷幼平等[10]的報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)L1-21在柑橘葉片上呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，如48 h定殖數(shù)量是10 min的17.69倍(葉肉)和19.71倍(葉表)，這或許與取樣時(shí)間長(zhǎng)短及菌株本身的定殖特性有關(guān)。葉肉中L1-21定殖量穩(wěn)定增長(zhǎng)的趨勢(shì)說(shuō)明葉肉更適合其定殖，而葉表中18 h出現(xiàn)降幅可能與接種后次日白天所受環(huán)境因素的變化有關(guān)[11]。金勤等[12]在油茶上通過(guò)葉部噴施Y13UV-GFP菌懸液，發(fā)現(xiàn)Y13UV具有向下傳導(dǎo)的能力。本次頂部單梢噴施試驗(yàn)中，也得出相同的結(jié)論。另外，L1-21-GFP向下傳導(dǎo)到葉表的定殖量趨于穩(wěn)定，暗示其對(duì)葉表復(fù)雜的微環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，而傳導(dǎo)到葉肉后所呈現(xiàn)的菌含量不斷增加的趨勢(shì)，則可能與其在葉肉內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖有關(guān)。但L1-21-GFP傳導(dǎo)到葉表及葉肉內(nèi)的定殖數(shù)量較低，或許與低接種量(106cfu/mL)及其在柑橘葉面上的潤(rùn)濕、黏附、滲透等有關(guān)。因此田間使用時(shí)，建議提高L1-21的接種濃度，并輔以適量的表面活性劑，降低噴霧液滴的表面張力，充分潤(rùn)展，延長(zhǎng)其在柑橘葉片上的保濕及滯留時(shí)間[13]，以進(jìn)一步提升菌株的葉片定殖能力。

基于安全性及對(duì)果實(shí)品質(zhì)的延續(xù)性，枯草芽孢桿菌作為公認(rèn)的食品工業(yè)中應(yīng)用的安全微生物[14]，被逐漸應(yīng)用于采后果實(shí)的保鮮及病害防控[15-16]。直接浸泡油桃果實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌BS-331可顯著抑制油桃果實(shí)采后病害的發(fā)生，且其防效與納他霉素(300 mg/L)相當(dāng)[17]。陳欣怡等[18]用枯草芽孢桿菌9407菌懸液浸泡蘋果，發(fā)現(xiàn)菌株能在果實(shí)內(nèi)部定殖，但近表皮處果肉中的定殖量顯著高于近果心果肉中的定殖量。本研究也證實(shí)L1-21不僅能定殖于來(lái)源寄主(本主)新津，還能在其他柑橘品種上定殖，顯示出良好的應(yīng)用潛力。其中在浸泡處理0.5 h后，L1-21的定殖能力更強(qiáng)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)L1-21在果皮內(nèi)的定殖能力優(yōu)于果肉。整體來(lái)看(表4)，柑橘浸泡后的6～24 h是生防芽孢桿菌L1-21菌株在果皮中的急速生長(zhǎng)期：24 h定殖量與6 h相比，砂糖橘增長(zhǎng)5.23倍，塘房橘增長(zhǎng)4.16倍，椪柑增長(zhǎng)3.63倍，清香橘增長(zhǎng)3.29倍，沃柑增長(zhǎng)1.48倍。L1-21在不同果實(shí)內(nèi)定殖能力的差異，或許與品種本身的形態(tài)及生理生化等特征(果皮厚度、果皮細(xì)胞間隙及果肉含糖量等)相關(guān)。

最近，L1-21菌株被證實(shí)可有效防治番茄采后病害——灰霉病[7]，更早時(shí)有利用解淀粉芽孢桿菌DH-4成功防治柑橘采后病害——綠霉病的成功報(bào)道[19]。在本研究中，L1-21-GFP對(duì)柑橘綠霉病菌的平板抑菌圈直徑為37.02 mm(結(jié)果未列出)，浸泡處理果實(shí)30 min，注射接種綠霉病菌孢子和只記錄發(fā)病率的條件下，該菌株對(duì)果實(shí)綠霉病的防效3 d為100%、5 d為80.36%，說(shuō)明L1-21對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病的防控也有著廣闊的應(yīng)用前景。

枯草芽孢桿菌L1-21是一株能高效抑制柑橘黃龍病的柑橘內(nèi)生細(xì)菌，本研究結(jié)果對(duì)拓展其應(yīng)用范圍、田間應(yīng)用技術(shù)方法及應(yīng)用前景具有指導(dǎo)意義，但大田條件下的菌體細(xì)胞定殖量對(duì)黃龍病的防效以及后續(xù)貯藏期果實(shí)綠霉病發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)性還有待進(jìn)一步證實(shí)。